G-kvadrupleksi v človeški DNA in njihov terapevtski

G-kvadrupleksi v človeški DNA in njihov terapevtski potencial

Avtorici: Špela Barbič, asist. dr. Dunja Urbančič, mag. farm. I Recenzent: prof. dr. Janez Plavec

Deoksiribonukleinska kislina (DNA) je osnovna molekula življenja, ki v obliki genskega materiala nosi navodila za izgradnjo vseh živih bitij. Ob povezovanju nukleozidov tvori najprepoznavnejšo obliko DNA – dvojno vijačnico. Molekule DNA pa so strukturno dinamične in zmožne zvijanja v manj znane sekundarne strukture. Ena izmed sekundarnih struktur, ki se pojavlja po celotnem genomu, so G-kvadrupleksi (G4). V pričujočem prispevku bomo predstavili, kaj DNA G4 so, kakšna je njihova struktura, kje v našem genomu nastajajo in kakšen je njihov potencial v smislu terapevtskih tarč (1).

STRUKTURA G-KVADRUPLEKSOV

G4 nastajajo v območjih enoverižne DNA, ki so bogata s pari gvanin–citozin (GC) in so zato sposobni zvitja gvaninov v sekundarne strukture. Osnovo G4 gradijo tako imenovani G-kvarteti, ki jih sestavljajo štiri gvaninske baze v ravnini, stabilizirane z vodikovimi vezmi, tako da je vsaka gvaninska baza povezana z drugo bazo prek dveh vezi (slika 1A). Dva ali več G-kvartetov, naloženih eden na drugega, skupaj tvori G4 (slika 1B-D). Poleg vodikovih vezi so G4 stabilizirani z monovalentnimi kationi v centru med štirimi bazami G-kvarteta. Največjo moč stabilizacije imajo K+, sledijo Na+, NH4+ in Li+ ioni. G4 se med seboj razlikujejo po vzorcu nalaganja G-kvartetov enega na drugega, torej po topologiji. Orientirani so lahko paralelno (slika 1B), antiparalelno (slika 1C) ali hibridno (slika 1D). Kako se bodo uredili, je odvisno od različnih povezav med gvanini in orientacijo verig DNA. G4 lahko nastanejo iz ene same verige DNA ali iz več enoverižnih molekul DNA. Pomembno je poudariti, da G4 sicer nastajajo tudi v enoverižni RNA ter med enoverižnima RNA in DNA, kjer imajo pomembno funkcijo, na primer pri translaciji genov. Naj jih na tem mestu le omenimo in se v prispevku nadalje osredotočimo na DNA G4 (2, 3, 4).

Ena izmed najpomembnejših raziskovalnih skupin, ki je in še vedno orje ledino na področju proučevanja 3D strukture G4, je skupina prof. dr. Janeza Plavca s Slovenskega NMR centra na Kemijskem inštitutu v Ljubljani. S pomočjo NMR spektroskopije določajo strukturo G4, kar pomembno prispeva k načrtovanju ligandov in potencialnih zdravilnih učinkovin. (5,6,7)

Slika 1: Osnovni element G4 je G-kvartet (A), ki ga sestavljajo štirje gvanini in monovalentni ion (označen z zeleno). Več G-kvartetov se združuje v G4, ki tvorijo različne topologije: paralelno (B), antiparalelno (C) ali hibridno (D). Povzeto po (3).

LOKALIZACIJA in FUNKCIJE G-KVADRUPLEKSOV V CELICI

Na osnovi poznavanja strukturnih značilnosti G4 so bila v človeškem genomu s pomočjo

algoritmov določena mesta, kjer se lahko tvorijo intramolekularni G4. To so z gvaninom bogata zaporedja tipa 5-G≥3N1–7G≥3N1–7G≥3N1–7G≥3-3, pri čemer je N katerakoli nukleinska baza. Po novejših raziskavah in izračunih naj bi bilo takih zaporedij v človeškem genomu več sto tisoč. Regije, bogate s potencialnimi G4, so telomere, promotorska mesta genov in 5' nekodirajoča mesta genov, torej regije, ki izkazujejo visoko gensko nestabilnost in ki so povezane z regulacijo genoma. Po izračunu potencialnih G4 v človeškem genomu se je pojavilo vprašanje, ali se G4 tudi dejansko tvorijo na teh mestih in vivo. Za natančnejši »zemljevid« G4 v človeškem genomu je bilo tako potrebnih več raziskav, ki so s pomočjo specifičnih protiteles in malih sinteznih ligandov identificirali in potrdili mesta tvorbe G4 v posameznih regijah DNA tudi v celicah (2, 8).

Vloga G-kvadrupleksov v telomerah

Telomere so območja ponavljajočega se nukleotidnega zaporedja, ki se nahajajo na koncih vseh kromosomov in preprečujejo izgubo genetskega materiala med replikacijo DNA ter onemogočajo interkromosomske povezave. Del telomer se izgubi pri skoraj vsaki celični delitvi, zato se telomere tekom življenja večine celic krajšajo. G4 so sprva opazili v območjih telomer, ki so sestavljena iz ponavljajočih se zaporedij TTAGGG. G4 ščitijo telomere pred mehanizmi za popravilo DNA (slika 2), zavirajo rekombinacijo in inhibirajo podaljševanja telomer s telomerazo. V primeru, da celica razvije mehanizme, s katerimi onemogoča tvorjenje G4 v telomerah, se spodbudi delovanje telomeraze, kar lahko vodi v tumorsko spremembo celice. Za tumorske celice je namreč značilno močno izraženo delovanje telomeraze, ki omogoča neomejeno proliferacijo celic (2, 9).

Slika 2: G4 zaščitijo konce telomer pred nukleazami in popravljalnimi mehanizmi DNA (A). Povzeto po (8).

Vloga G-kvadrupleskov v promotorskih regijah

Poleg telomer so z G4 zelo bogate tudi nekatere promotorske regije. Promotorska regija je območje v DNA, ki je ključnega pomena za začetek prepisa DNA v RNA. Običajno je nastanjena na 5' mestu genov, nanjo pa se lahko vežejo različni proteini, ki uravnavajo prepis genov. V promotorjih, bogatih z gvanini, G4 sodelujejo pri regulaciji tega prepisa. Še posebej veliko zaporedij, ki omogočajo nastanek G4, je bilo odkritih v promotorskih regijah protoonkogenov. Proto-onkogeni so sicer običajni geni, ki z mutacijo (pogosto v promotorskem mestu) postanejo onkogeni in spodbudijo pretvorbo celice v rakavo. Med najbolj znanimi primeri protoonkogenov je proto-onkogen c-MYC, v katerega promotorskem mestu so dokazali tvorbo G4. Stabilizacija strukture G4 v tem delu genoma inhibira transkripcijo gena c-MYC, kar pomeni, da bo gen v teh primerih znižano izražan (slika 3). V primeru prisotne mutacije v promotorski regiji, ki destabilizirala strukturo G4, pa se izražanje c-MYC poveča, kar vodi celico v neomejeno podvojevanje in tumorsko spremembo. Regulacija prepisa genov prek tvorbe G4 je bila nadalje potrjena z vsegenomskimi študijami tudi pri vrsti drugih genov in pri različnih vrstah živih bitij (1, 2, 8, 10).

Slika 3: Stabilizacija G4 v nekaterih promotorskih regijah inhibira prepisovanje genov. Prirejeno po (8).

Vloga G-kvadrupleksov pri podvojevanju DNA

Pri podvojevanju DNA predvidevajo, da G4 igrajo dvojno vlogo. Na nekaterih mesti DNA G4 predstavljajo ovire za DNA polimerazo (slika 4), kar prepreči nadaljevanje podvojevanja, povzroči poškodbe DNA in poveča genomsko nestabilnost. Na drugi strani v določenih regijah DNA G4

Slika 4: Kadar so pri podvojevanju DNA odsotne specializirane helikaze, ki razvijajo G4, predstavljajo G4 ovire za DNA-polimerazo. Prirejeno po (5).

usmerjajo in s tem spodbujajo začetek podvojevanja DNA. Na kakšen način G4 usmerijo podvojevanje DNA in kako se tvorjenje G4 dopolnjuje z ostalimi regulacijskimi mehanizmi podvojevanja DNA, ostaja za zdaj še nerazjasnjeno (1, 2).

TERAPEVTSKI POTENCIAL

Vplivi G4 na telomerazno aktivnost, transkripcijo proto-onkogenov in stabilnost DNA so spodbudili zanimanje za G4 kot možne molekularne tarče pri zdravljenju raka. Za razvoj protitumorskih učinkovin na podlagi G4 je spodbudno dejstvo, da imajo nekateri tipi rakavih celic signifikantno večje število G4 v primerjavi z normalnimi celicami (1, 2).

Do danes je bilo tako zasnovanih in predklinično ovrednotenih že več kot tisoč malih molekul, ki se vežejo na G4. Take molekule so na primer PhenDC3, 360A in RHPS4, za kateri je bilo ugotovljeno, da povzročajo bodisi prelome dvoverižne DNA v tumorskih celicah in aktivirajo mehanizme za popravilo DNA bodisi zavrejo translacijo reportrske mRNA in zmanjšujejo telomerazno aktivnost. Zato bi bili lahko omenjeni in drugi podobno delujoči stabilizatorji G4 uspešni pri zdravljenju tumorjev z oslabljenimi mehanizmi za popravljanje poškodb DNA. Molekule, ki stabilizirajo G4, delujejo sinergistično v kombinaciji z inhibitorji proteinov, ki sodelujejo pri popravljanju poškodb DNA. Trenutno je v fazi kliničnega testiranja stabilizator G4 CX-5461, in sicer za zdravljenje raka dojk pri pacientih z mutacijo v BRCA1/2 (1, 11, 12).

Poleg izkoriščanja poškodb DNA, ki jih povzročijo stabilizatorji G4, je eden izmed možnih pristopov pri zdravljenju raka uporaba stabilizatorjev G4 za manipulacijo transkripcije genov, ki so vpleteni v rast in razvoj tumorjev. Veliko stabilizatorjev G4 dokazano spremeni nivo izražanja različnih genov. Stabilizatorji G4 običajno niso selektivni za posamezen gen, torej se v in vivo pogojih vežejo na G4 v številnih promotorskih regijah in tako vplivajo na izražanje mnogo genov in na samo izražanje tarčnega gena. Na tak način sicer v tumorskih celicah hkrati zmotijo več metabolnih poti, ki so pomembne za proliferacijo, in dosežejo sinergistični učinek, vendar izzovejo tudi toksične učinke na zdravih celicah (1, 13).

Že nekaj časa se raziskovalne skupine po svetu zato ukvarjajo z vprašanjem, kako izboljšati selektivnost stabilizatorjev G4, da bi z njimi lahko regulirali izražanje specifičnih genov, ki so ključni pri proliferaciji tumorskih celic. Eden izmed genov, ki je prekomerno izražen pri skoraj vseh tumorjih, je že predhodno omenjen proto-onkogen c-MYC. c-MYC je transkripcijski faktor, ki aktivira prepis nekaterih genov, vpletenih v celično podvojevanje, hkrati pa zavira prepis genov, vpletenih v zaustavitev celične rasti. Ker je c-MYC povečano izražan v tumorjih, bi bilo specifično zniževanje izražanja tega gena dober pristop pri zdravljenju raka. Do danes je c-MYC veljal za tarčo, ki je ni mogoče ciljati z zdravilnimi učinkovinami. Vendar so ravno raziskave na področju G4 pokazale, da je možno sintetizirati za c-MYC selektiven stabilizator G4, molekulo oblike štiriperesne detelje, imenovane IZCZ-3, ki inhibira ekspresijo c-MYC in deluje toksično na tumorske celice, ne pa tudi na zdrave celice. Do sedaj sicer v fazi kliničnih testiranj še ni nobenega selektivnega stabilizatorja G4. Problem selektivnosti stabilizatorjev G4 tako še ni popolnoma rešen. Selektivnost je težko doseči, saj se po strukturi G4 v celotnem genomu le malo razlikujejo. Kljub temu pa imajo učinkovine, kot je IZCZ-3, velik potencial za razvoj še boljših stabilizatorjev G4, ki bi lahko bili v prihodnje nepogrešljivi pri tarčnem zdravljenju rakavih obolenj (14, 15).

ZAKLJUČEK

Dosedanje raziskave o DNA G4 nedvomno potrjujejo napovedi, da imajo G4 pomembne biološke funkcije. Kmalu zatem, ko je bil dokazan njihov vpliv na

prepisovanje genov, telomer in stabilnost DNA, so G4 postali tudi obetavne nove molekularne tarče pri zdravljenju raka. Vseeno pa ostaja o G4 še veliko neodgovorjenih vprašanj: kakšni so točni mehanizmi vpliva G4 na prepis genov, zakaj najdemo v nekaterih rakavih celicah več G4 v primerjavi z normalnimi celicami in kako izboljšati selektivnost stabilizatorjev G4. Odgovori na ta in podobna vprašanja bi v prihodnje pripomogli, da terapije, ki temeljijo na manipulaciji G4, preidejo tudi v klinično prakso.

1. Spiegel J, Adhikari S, Balasubramanian S. The Structure and Function of DNA G-Quadruplexes. Trends in Che- VIRI mistry. 2020. doi: 10.1016/j.trechm.2019.07.002 2. Hänsel-Hertsch R, Di Antonio M, Balasubramanian S. DNA G-quadruplexes in the human genome: detection, functions and therapeutic potential. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017; 18(5): 279-284. doi:10.1038/nrm.2017.3 3. Ma Y, Iida K, Nagasawa K. Topologies of G-quadruplex: Biological functions and regulation by ligands [published online ahead of print, 2020 Jan 13]. Biochem Biophys Res Commun. 2020;S0006-291X(20)30052-8. doi:10.1016/j.bbrc.2019.12.103 4. Yang D. G-Quadruplex DNA and RNA. Methods Mol Biol. 2019;2035:1-24. doi:10.1007/978-1-4939-9666-7_1 5. Čeru S, Šket P, Prislan I, Lah J, Plavec J. A new pathway of DNA G‐quadruplex formation. Angewandte Chemie. 2014 May 5;126(19):4981-4. 6. Kotar A, Rigo R, Sissi C, Plavec J. Two-quartet kit* G-quadruplex is formed via double-stranded pre-folded structure. Nucleic acids research. 2019 Mar 18;47(5):2641-53. 7. Kovačič M, Podbevšek P, Tateishi-Karimata H, Takahashi S, Sugimoto N, Plavec J. Thrombin binding aptamer G-quadruplex stabilized by pyrene-modified nucleotides. Nucleic acids research. 2020 Apr 17;48(7):3975-86. 8. Rhodes D, Lipps HJ. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 2015; 43(18): 8627-8637. doi:10.1093/nar/gkv862 9. Shammas MA. Telomeres, lifestyle, cancer, and aging. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2011; 14(1): 28-34. doi:10.1097/ MCO.0b013e32834121b1 10. Siddiqui-Jain A, Grand CL, Bearss DJ, Hurley LH. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99(18): 11593-11598. doi:10.1073/ pnas.182256799 11. Xu H, Di Antonio M, McKinney S, et al. CX-5461 is a DNA G-quadruplex stabilizer with selective lethality in BRCA1/2 deficient tumours. Nat Commun. 2017; 8: 14432. Published 2017 Feb 17. doi:10.1038/ncomms14432 12. De Cian A, Cristofari G, Reichenbach P, De Lemos E, Monchaud D, Teulade-Fichou MP, Shin-Ya K, Lacroix L, Lingner J, Mergny JL. Reevaluation of telomerase inhibition by quadruplex ligands and their mechanisms of action. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2007 Oct 30;104(44):17347-52. 13. Marchetti C, Zyner KG, Ohnmacht SA, et al. Targeting Multiple Effector Pathways in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma with a G-Quadruplex-Binding Small Molecule. J Med Chem. 2018; 61(6): 2500-2517. doi:10.1021/acs.jmedchem.7b01781 14. Asamitsu S, Obata S, Yu Z, Bando T, Sugiyama H. Recent Progress of Targeted G-Quadruplex-Preferred Ligands Toward Cancer Therapy. Molecules. 2019; 24(3): 429. Published 2019 Jan 24. doi:10.3390/molecules24030429 15. Hu MH, Wang YQ, Yu ZY, et al. Discovery of a New Four-Leaf Clover-Like Ligand as a Potent c-MYC Transcription Inhibitor Specifically Targeting the Promoter G-Quadruplex. J Med Chem. 2018; 61(6): 2447-2459. doi:10.1021/acs.jmedchem.7b01697

Te ob listanju Spatule srbijo prsti? Ali rad prebiraš članke z aktualno (pol)strokovno vsebino in o njih razglabljaš s prijatelji? Vabimo te, da svojo zvedavost in vedoželjnost deliš še z drugimi študenti in študentkami naše fakultete. Obvesti glavnega urednika Spatule, da občasno kodraš svoje možgančke z zanimivimi farmacevtskimi, kozmetološkimi, industrijskimi ali laboratorijsko-biomedicinskimi članki, katerih izsledke želiš deliti z bralci Spatule. Podrezaj ga tudi, če čutiš zgolj navdih po ustvarjanju, pa nisi prepričan_a, kako ga utelesiti. Svoje prispevke, ideje in vprašanja lahko pošlješ na: spatula@dsfs.si.

Uredniški odbor Spatule