Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis | Helen Hermsdorff / Josefina Bressan by Editora Rubio

SOBRE AS ORGANIZADORAS

Helen Hermana Miranda Hermsdorff Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Mestre em Nutrição e Metabolismo pela Universidad de Navarra (Unav), Espanha. Doutora em Alimentação, Fisiologia e Saúde pela Unav. Professora adjunta do Departamento de Nutrição e Saúde da UFV.

mente aos hábitos alimentares, considerados os principais fatores de risco

OUTROS TÍTULOS DE INTERESSE

modificáveis. Desse modo, a genômica nutricional é a ciência capaz de

Dietoterapia nas Doenças do Adulto

trazer maior conhecimento, com base em evidências científicas, sobre a interação de genes e nutrientes e sua influência sobre a prevenção e/ou o desenvolvimento das DCNT. Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis é composta por 24 capítulos com linguagem técnica, mas também objetiva e clara, de modo a proporcionar discussão mais didática sobre a interação gene-nutriente nas DCNT entre acadêmicos, pesquisadores e profissionais da área da saúde. Os primeiros oito capítulos tratam dos marcadores (epi)genéticos e de seus processos regulatórios, dos aspectos epidemiológicos e fisiopatológicos das DCNT e, finalmente, dos conceitos, dos biomarcadores e das tecnologias mais relevantes em genômica nutricional. Dessa maneira, tais capítulos oferecem referencial suficiente para compreender a interação gene-nutriente que será abordada nos 14 capítulos seguintes.

Josefina Bressan

Estes apresentarão ao leitor a genômica nutricional para diferentes nutrien-

Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Especialista em Nutrição Clínica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Mestre em Microbiologia Agrícola pela UFV. Doutora em Fisiologia e Nutrição pela Universidad de Navarra (Unav), Espanha. Professora titular do Departamento de Nutrição e Saúde da UFV.

tes (ácidos graxos, minerais etc.) e compostos bioativos (carotenoides, fenólicos etc.), DCNT (obesidade, síndrome metabólica, doenças cardio-

Aline Marcadenti de Oliveira Flávia Moraes Silva

Dietoterapia nas Doenças Gastrintestinais do Adulto Aline Marcadenti de Oliveira Flávia Moraes Silva Valesca Dall’alba

Interpretação de Exames Laboratoriais Aplicados à Nutrição Clínica Larissa Calixto-Lima Nelzir Trindade Reis

Nutrição Clínica – Bases para Prescrição Nelzir Trindade Reis Larissa Calixto-Lima

vasculares e câncer) e tecnologias ômicas (epigenômica, transcriptômica, proteômica, metabolômica e metagenômica). A obra contempla a genômica nutricional sob a perspectiva da ética e da bioestatística, fundamentais no desenvolvimento de qualquer trabalho científico. Todos os capítulos foram escritos por pesquisadores com expertise na área, o que resultou em uma publicação de muita qualidade.

Nutrigenômica Júlia Dubois Moreira

Vitaminas, Minerais e Eletrólitos – Aspectos Fisiológicos, Nutricionais e Dietéticos Maria Eliana Madalozzo Schieferdecker Rubia Daniela Thieme Daniela Barbieri Hauschild

Áreas de interesse Nutrição Genética

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Hermsdorff - Genomica Nutricional 2.indd 1

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Co p y r i g h t©2019Ed i t o r aRu b i oL t d a .He r ms d o r f f / Br e s s a n .Ge n ô mi c aNu t r i c i o n a l n a sDo e n ç a sCr ô n i c a sNã oTr a n s mi s s í v e i s .Al g u ma sp á g i n a s ,n ã os e q u e n c i a i s ,ee mb a i x ar e s o l u ç ã o .

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Helen Hermana M. Hermsdorff Joseﬁna Bressan

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O R G A N I Z A D O R A S

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Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis Copyright © 2019 Editora Rubio Ltda. ISBN 978-85-8411-109-1 Todos os direitos reservados. É expressamente proibida a reprodução desta obra, no todo ou em parte, sem autorização por escrito da Editora. Produção Equipe Rubio Editoração Eletrônica Elza Ramos Capa Bruno Sales Imagens de capa ©iStock.com / AYDINOZON / ClaudioVentrella

CIP-BRASIL. CATALOGAÇÃO-NA-FONTE SINDICATO NACIONAL DOS EDITORES DE LIVROS, RJ G293

Genômica nutricional nas doenças crônicas não transmissíveis / organização Helen Hermana Miranda Hermsdorff, Josefina Bressan; colaboração Adriano Marçal Pimenta ... [et al.] – 1. ed. – Rio de Janeiro: Rubio, 2019. 432 p.; 24cm. Inclui bibliografia e índice ISBN 978-85-8411-109-1

1. Nutrição – Aspectos genéticos. 2. Nutrigenômica. 3. Doenças crônicas – Aspectos nutricionais. I. Bressan, Josefina. II. Pimenta, Adriano Marçal. 19-56795

CDD: 612.3 CDU: 612.39

Editora Rubio Ltda. Av. Franklin Roosevelt, 194 s/l 204 – Castelo 20021-120 – Rio de Janeiro – RJ Telefax: 55(21) 2262-3779 • 2262-1783 E-mail: rubio@rubio.com.br www.rubio.com.br Impresso no Brasil Printed in Brazil

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Josefina Bressan Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Especialista em Nutrição Clínica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Mestre em Microbiologia Agrícola pela UFV. Doutora em Fisiologia e Nutrição pela Universidad de Navarra (Unav), Espanha. Professora titular do Departamento de Nutrição e Saúde da UFV.

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Organizadoras

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Adriano Marçal Pimenta Enfermeiro pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Mestre em Saúde e Enfermagem pela UFMG. Doutor em Saúde e Enfermagem pela UFMG. Pós-doutorado em Saúde Pública pela Universidad de Navarra (Unav), Espanha. Professor do Departamento de Enfermagem Materno-Infantil e Saúde Pública da Escola de Enfermagem da UFMG.

Aline Marcadenti de Oliveira Nutricionista pela Universidade do Rio dos Sinos (Unisinos), RS. Especialista em Nutrição Clínica pela Associação Brasileira de Nutrição (Asbran). Mestre em Ciências Médicas: Cardiologia pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Doutora em Cardiologia e Ciências Cardiovasculares pela UFRGS. Pesquisadora do Instituto de Pesquisa (IP) do Hospital do Coração de São Paulo (HCor). Professora permanente do Programa de Pós-graduação em Ciências da Nutrição da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA), RS. Professora permanente do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde: Cardiologia do Instituto de Cardiologia/ Fundação Universitária de Cardiologia do Rio Grande do Sul (UFCSPA).

Pesquisadora no Departamento de Endocrinologia da Faculdade de Medicina da USP.

Ana Paula Silva Caldas Nutricionista pela Universidade Federal do Maranhão (UFMA). Mestre em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutoranda em Ciência da Nutrição pela UFV.

André Gustavo Vasconcelos Costa Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Doutor em Ciência e Tecnologia dos Alimentos pela UFV, com período sanduíche no Departamento de Ciencias de la Alimentación y Fisiología, da Universidad de Navarra (Unav), Espanha. Professor do Departamento de Farmácia e Nutrição do Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde, da Universidade Federal do Espírito Santo (Ufes).

Brenda Lee Simas Porto Química pela Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG. Mestre e doutora em Química pela UFJF. Pós-doutorados na Embrapa Agroenergia (Brasília – DF) e na Universidade Federal de Alfenas (Unifal), MG. Professora adjunta no Departamento de Química da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Bruna Cristina dos Santos Cruz Alinne Paula de Almeida Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Doutoranda em Ciência da Nutrição pela UFV.

Ana Maria Pita Lottenberg Nutricionista pela Universidade São Camilo. Doutora e Mestre em Nutrição em Ciências dos Alimentos pela Universidade de São Paulo (USP), com estágio sanduíche em Ottawa Heart Institute, Ottawa, Canadá. Coordenadora do Curso de Especialização em Nutrição nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis do Hospital Israelita Albert Einstein, SP.

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Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Pós-graduação em Fitoterapia e Suplementação Clínica e Esportiva, na Universidade Estácio de Sá (Unesa), RJ. Residência multiproﬁssional em Oncologia no Instituto Nacional de Câncer (Inca), RJ. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Doutoranda em Ciência da Nutrição pela UFV.

Carine Ribeiro Pessoa Bacharel em Ciências Biológicas pela Universidade de Brasília (UnB), DF. Mestre em Patologia Molecular pela UnB. Doutora em Biologia Celular e Estrutural pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Colaboradores

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Carla Barbosa Nonino

Eliane Lopes Rosado

Nutricionista pela Pontifícia Universidade Católica de Campinas (PUC-Campinas), SP. Mestre e doutora em Ciências Médicas pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP). Professora-associada da FMRP/USP. Coordenadora do laboratório de Estudos em Nutrigenômica da FMRP/USP.

Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre e doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV. Professora-associada do Departamento de Nutrição e Dietética do Instituto de Nutrição Josué de Castro da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Nutrição Clínica (PPGNC) da UFRJ.

Carolina Ferreira Nicoletti Nutricionista pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP). Mestre e doutora em Ciências Médicas pela FMRP/USP, com estágio sanduíche no Centro de Investigación en Nutrición da Universidad de Navarra (Unav), Espanha. Pós-doutoranda em Clínica Médica pela FMRP/USP.

Daniela Fojo Seixas Chaves Nutricionista pela Universidade Federal do Paraná (UFPR). Mestre e doutora em Ciências (Bioquímica) pela UFPR. Pós-doutorado pelo Laboratório de Nutrição e Metabolismo da Escola de Educação Física e Esporte da Universidade de São Paulo (USP). Pós-doutorado pelo Scripps Resarch Institute (TSRI), La Jolla, Estados Unidos. Pós-doutorado pelo Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP.

Daniela Mayumi Usuda Prado Rocha Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Doutoranda em Ciência da Nutrição pela UFV.

Fabyano Fonseca e Silva Zootecnista pela Universidade Federal de Lavras (Ufla), MG. Mestre em Estatística pela Ufla. Doutor em Estatística pela Ufla. Pós-doutorado em Estatística Genética pela Universidade de Wisconsin, Estados Unidos e pela Universidade de Wageningen, Holanda. Professor do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Fernanda Cristina Carvalho Mattos Magno Nutricionista pela Universidade Estácio de Sá (Unesa), RJ. Mestre em Clínica Médica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Doutora em Ciências Nutricionais pela UFRJ. Pós-doutoranda em Bioquímica Nutricional no Instituto de Nutrição Josué de Castro (INJC) da UFRJ. Nutricionista do Programa de Obesidade e Cirurgia Bariátrica (Prociba) do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF) da UFRJ. Docente do módulo de Obesidade e Cirurgia Bariátrica em Pós-graduação Latu Sensu e do Programa de Pós-graduação em Nutrição Clínica (PPGNC) da UFRJ.

Danielle Cristina Guimarães da Silva Nutricionista pela Universidade Federal de Ouro Preto (Ufop), MG. Especialista em Nutrição Clínica pela Sociedade Brasileira de Nutrição (Asbran). Mestre em Ciências dos Alimentos pela Universidade Federal de Lavras (Uﬂa), MG. Doutora em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Professora adjunta do curso de Nutrição da Universidade Federal do Oeste da Bahia (Ufob).

Dennys Esper Cintra Nutricionista pela Universidade Federal de Alfenas (Unifal), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV). Doutor em Clínica Médica pela Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), SP. Pós-doutorado em Clínica Médica pela Unicamp. Professor da Faculdade de Ciências Aplicadas da Unicamp.

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Fernando Luiz Pereira de Oliveira Estatístico pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Mestre em Estatística pela UFMG. Doutor em Estatística pela UFMG. Professor do Departamento de Estatística da Universidade Federal de Ouro Preto (Ufop), MG.

Giana Zarbato Longo Nutricionista pela Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Mestre em Saúde Pública – Epidemiologia pela Universidade de São Paulo (USP). Doutor em Saúde Pública – Epidemiologia pela USP. Pós-doutorado em Saúde Pública pela London School of Hygiene and Tropical Medicine, Inglaterra.

Hércia Stampini Duarte Martino Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV.

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Janaina Lombello Santos Donadio Nutricionista pela Universidade de São Paulo (USP). Mestre e doutora em Ciência dos Alimentos pela USP. Pós-doutorado em Epidemiologia Genética do Câncer pela University of Illinois, Estados Unidos. Pesquisadora do Food Research Center (FoRC) na USP.

José Luiz Marques Rocha Nutricionista pela Universidade Federal de Ouro Preto (Ufop), MG. Especialista em Nutrição Humana e Saúde pela Universidade Federal de Lavras (Uﬂa), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutor em Ciência da Nutrição pela UFV com estágio sanduíche no Centro de Investigación en Nutrición – Universidad de Navarra (Unav), Espanha. Pós-doutorado em Nutrição e Saúde pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Professor do curso de Nutrição da Universidade Federal do Espírito Santo (Ufes), campus Vitória.

Josicelli Souza Crispim Bacharel em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Microbiologia Agrícola pela UFV. Doutoranda em Microbiologia Agrícola pela UFV.

Júlia Cristina Cardoso Carraro Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Doutora em Ciência da Nutrição pela UFV com estágio sanduíche no Centro de Alimentación y Fisiologia da Universidad de Navarra (Unav), Espanha. Professora adjunta da área de Nutrição Clínica da Universidade Federal de Ouro Preto (Ufop), MG.

Karla Pereira Balbino Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Doutoranda em Ciência da Nutrição pela UFV.

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Kátia Josiany Segheto Educadora Física pela Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG. Especialista em Fisiologia do Exercício e Avaliação Morfofuncional pela Universidade Gama Filho. Especialista em Aspectos Metodológicos e Conceituais da Pesquisa Cientíﬁca pela UFJF. Mestre em Educação Física pela Universidade São Judas Tadeu (USJT), SP. Doutora em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV). Professora do curso de graduação em Licenciatura em Educação Física no Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais (IF Sudeste), campus Rio Pomba.

Leandro Licursi de Oliveira Farmacêutico-bioquímico pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP-USP). Mestre e doutor em Imunologia Básica e Aplicada pela Universidade de São Paulo (USP). Professor-associado do Departamento de Biologia Geral da Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Leonardo de Azevedo Peixoto Engenheiro-agrônomo pelo Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo (Ufes). Mestre em Genética e Melhoramento pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutor em Genética e Melhoramento pela UFV. Pós-doutorado em Genética e Melhoramento pela UFV. Data Scientist Specialist na Bayer Crop Science, MG.

Leonardo Lopes Bhering Engenheiro-agrônomo pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Genética e Melhoramento de Plantas pela Universidade Federal de Lavras (Uﬂa). Doutor em Genética e Melhoramento pela UFV. Pós-doutorado em Estatística Genética e Quantitativa pela University of California at Riverside, Estados Unidos. Professor do Departamento de Biologia Geral da UFV.

Letícia De Nadai Marcon Nutricionista pela Universidade Federal de Ouro Preto (Ufop), MG. Mestre em Ciências Biológicas pelo Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Ufop (Nupeb/Ufop). Doutora em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Lidiane Aparecida Silva Engenheira-agrônoma pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Genética e Melhoramento pela UFV.

Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV, com estágio sanduíche pelo Food Science and Nutrition Department, Purdue University, Estados Unidos. Pós-doutorado em Fitoquímicos, Bioquímica e Biologia Celular no Nutrition and Food Science Department da Texas A&M University, Estados Unidos. Professora-associada do Departamento de Nutrição e Saúde da UFV. Membro da Comissão Coordenadora do Programa de Pósgraduação em Ciência da Nutrição da UFV (PPGCN/UFV).

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Doutora em Genética e Melhoramento pela UFV. Pós-doutoranda em Genética e Melhoramento pela UFV. Professora do Centro Universitário Atenas (Uniatenas), MG.

Lílian Lelis Lopes Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Doutoranda em Ciência da Nutrição pela UFV.

Maria Silvia Ferrari Lavrador Nutricionista pela Universidade Federal de Alfenas (Unifal), MG. Especialista em Nutrição Materno-Infantil pela Universidade Federal de São Paulo (Unifesp). Especialista em Nutrição em Doenças Crônicas Não Transmissíveis pelo Instituto de Ensino e Pesquisa do Hospital Israelita Albert Einstein (IEP/Hiae), SP.

Lisiane Lopes da Conceição

Mestre em Nutrição pela Unifesp.

Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Microbiologia Agrícola pela UFV. Doutora em Ciência da Nutrição pela UFV. Pós-doutoranda em Ciência da Nutrição pela UFV.

Professora visitante no IEP/Hiae.

Manoela Maciel dos Santos Dias Engenheira de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre e doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV. Pós-doutorado em Ciência da Nutrição pela UFV. Professora do curso de Engenharia Química e do Curso de Nutrição da Univiçosa/Viçosa, MG.

Marcela Augusta de Souza Pinhel Bióloga pelo Centro Universitário de Rio Preto (Unirp), SP. Mestre e doutora em Ciências da Saúde pela Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (Famerp), SP. Pós-doutorado em Nutrigenômica pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP). Pós-doutoranda em Neurogenética pela Famerp.

Marcelo Macedo Rogero Nutricionista pela Universidade de São Paulo (USP). Especialista em Nutrição em Esporte pela Associação Brasileira de Nutrição (Asbran). Mestre e Doutor em Ciência dos Alimentos pela USP. Pós-doutorado em Ciência dos Alimentos pela USP. Pós-doutorado pela Faculdade de Medicina da Universidade de Southampton, Inglaterra. Professor-associado do Departamento de Nutrição da Faculdade de Saúde Pública da USP. Coordenador do Laboratório de Genômica Nutricional e Inﬂamação (Genuin) da USP.

Maria do Carmo Gouveia Peluzio Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Agroquímica pela UFV. Doutora em Ciência pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Professora titular do Departamento de Nutrição e Saúde da UFV.

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Doutorado em Ciências pela Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP).

Mariana de Moura e Dias Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Doutoranda em Ciência da Nutrição pela UFV.

Mariana Grancieri Nutricionista pela Universidade Federal do Espírito Santo (Ufes). Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Ufes. Doutoranda em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV ), MG, com estágio sanduíche pela University of Illinois Urbana-Champaign, Estados Unidos.

Marina Franco Maggi Tavares Química pela Universidade de São Paulo (USP). Mestre em Química Analítica pela USP. Doutora em Química Analítica pela Michigan State University, Estados Unidos. Pós-doutorado em Metabolômica pela Faculty of Medicine da Imperial College London, Inglaterra. Professora titular do Departamento de Química Fundamental do Instituto de Química da USP.

Melissa Medeiros Markoski Graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Mestre e doutora em Biologia Celular e Molecular pela UFRGS. Pós-doutorados em Sinalização Celular pela Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUC-RS) e de Diagnóstico Fitossanitário pela UFRGS. Professora adjunta do Departamento de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA), RS. Professora permanente do Programa de Pós-graduação em Ciências da Nutrição da UFCSPA.

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Ramon de Freitas Santos

Bacharel em Bioquímica pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutora em Biologia Celular e Estrutural pela UFV. Professora da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde (Facisa – Univiçosa).

Graduado em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Ouro Preto (Ufop), MG. Mestre em Biologia Molecular pelo Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Ufop. Doutor em Bioquímica Agrícola pelo Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Pós-doutorado no Departamento de Biologia Celular pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP). Pós-doutorado no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular pela UFV. Professor do Instituto Federal do Rio Grande do Sul (IFRS).

Milessa da Silva Afonso Nutricionista pela Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (Unesp). Mestre em Ciências dos Alimentos-Nutrição Experimental pela Universidade de São Paulo (USP). Doutora em Ciências pela Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP), com estágio sanduíche na New York University, Estados Unidos.

Moysés Nascimento Estatístico pela Universidade Federal do Espírito Santo (Ufes). Mestre em Estatística Aplicada e Biometria pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutor em Estatística e Experimentação Agropecuária pela Universidade Federal de Lavras (Uﬂa), MG. Especialização em Seleção Genômica Ampla pela Universidad de Zaragoza, Espanha. Pós-doutorado em Análise de Dados Genômicos Via Métodos Econométricos na North Carolina State University, Estados Unidos. Professor do Departamento de Estatística da UFV.

Natália Elizabeth Galdino Alves Nutricionista pela Universidade Federal de Ouro Preto (Ufop), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutora em Ciência da Nutrição pela UFV, com estágio sanduíche pela University of Illinois Urbana-Champaign, Estados Unidos.

Nathane Pais Siqueira Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Nutricionista do Núcleo Ampliado de Saúde da Família e Atenção Básica (Nasf-AB) nos municípios de Cajuri-MG e Guaraciaba-MG.

Priscila Oliveira Barbosa Nutricionista pela Escola de Nutrição da Universidade Federal de Ouro Preto (Ufop), MG. Mestre em Ciências Biológicas pela Ufop. Doutora em Ciências Biológicas pela Ufop, com estágio sanduíche em Nutrição Molecular pela Robert Gordon University, Reino Unido. Professora substituta na Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG.

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Raquel Santana da Cruz Bacharelado e Licenciatura em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário São Paulo. Doutora em Ciência dos Alimentos pela Universidade de São Paulo (USP). Pós-doutorado em Oncologia pelo Lombardi Cancer Center, Georgetown University, Estados Unidos.

Renata Nascimento de Freitas Nutricionista pela Escola de Nutrição da Universidade Federal de Ouro Preto (Ufop), MG. Mestre e doutora em Bioquímica e Imunologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), com estágio sanduíche em Biologia Molecular pela University of Manchester, Reino Unido. Pós-doutorado em Epidemiologia Nutricional pela University of Cambridge, Reino Unido. Professora titular da Escola de Nutrição da Ufop.

Roberta de Oliveira Bernardes Nutricionista pela Universidade Federal do Espírito Santo (Ufes). Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Ufes. Professora-assistente do Departamento de Farmácia da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG.

Roberta Marcondes Machado Figueiredo Nutricionista pela Universidade Anhembi Morumbi, SP. Especialista em Nutrição nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis, pelo Instituto de Ensino e Pesquisa do Hospital Israelita Albert Einstein (IEP/Hiae). Doutora em Ciências pela Universidade de São Paulo (USP).

Sandra Aparecida dos Reis Nutricionista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Doutoranda em Ciência da Nutrição pela UFV.

Michelle Dias de Oliveira

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Silvia Almeida Cardoso

Thais Steemburgo

Farmacêutica-bioquímica pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP-USP). Mestre e doutora em Imunologia Básica e Aplicada pela Universidade de São Paulo (USP). Professora adjunta do Departamento de Medicina e Enfermagem da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Nutricionista pelo Instituto de Porto Alegre, RS. Mestre em Metabolismo e Nutrição: Endocrinologia pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Doutora em Metabolismo e Nutrição pela UFRGS, com estágio sanduíche no Centro de Alimentación y Fisiologia da Universidad de Navarra (Unav), Espanha. Pós-doutorado em Ciências Médicas no Departamento de Endocrinologia da UFRGS. Professora adjunta do Departamento de Nutrição da UFRGS. Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Alimentação, Nutrição e Saúde da UFRGS.

Silvia Maria Franciscato Cozzolino Nutricionista pela Universidade de São Paulo (USP). Mestre e doutora em Ciência dos Alimentos pela USP. Professora titular da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP.

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Aos meus pais, Hélio e Maria Visitadora. Aos meus filhos, Lucas e Júlia. Vocês são minha fortaleza! Helen Hermana Miranda Hermsdorff

Aos meus pais, Delfon e Luiza (in memoriam) pela iluminação de seus exemplos. Posso garantir que eles estão muito felizes com mais esta realização profissional e pessoal! Josefina Bressan

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Dedicatórias

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Agradecemos imensamente aos pesquisadores que contribuíram com precisão e excelência para a produção desta obra. De modo especial, agradecemos aos alunos e egressos do Programa de Pós-graduação em Ciência da Nutrição da Universidade Federal de Viçosa (PPGCN/UFV), MG, que nos apoiaram na elaboração dos nossos capítulos e sempre nos incentivaram para a produção de conhecimento científico de qualidade. As Organizadoras

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Agradecimentos

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As doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) são as maiores causas de morbimortalidade no mundo, com repercussões graves no desenvolvimento socioeconômico de países desenvolvidos e em desenvolvimento. Entre os fatores não modificáveis, destacam-se os fatores genéticos, ao mesmo tempo que os hábitos alimentares são considerados os principais fatores de risco modificáveis. Ou seja, há possíveis mudanças ao longo da vida. Desse modo, a genômica nutricional é a ciência capaz de trazer maior conhecimento, com base em evidências científicas, sobre a interação de genes e nutrientes e sua influência sobre a prevenção e/ou o desenvolvimento das DCNT. Apesar do crescente número de pesquisas e publicações acerca dessa temática no Brasil, as obras são ainda muito escassas. Assim, surgiu-nos a vontade de produzir esta obra, composta por 24 capítulos com linguagem técnica, mas também objetiva e clara, para proporcionar discussão mais didática sobre a interação genenutriente nas DCNT entre acadêmicos, pesquisadores e profissionais da área da saúde. Os primeiros oito capítulos tratam dos marcadores (epi)genéticos e de seus processos

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regulatórios, dos aspectos epidemiológicos e fisiopatológicos das DCNT e, finalmente, dos conceitos, dos biomarcadores e das tecnologias mais relevantes na genômica nutricional. Dessa maneira, tais capítulos oferecem referencial suficiente para compreender a interação gene-nutriente que será abordada nos próximos 14 capítulos. Estes apresentarão ao leitor a genômica nutricional para diferentes nutrientes (ácidos graxos, minerais etc.) e compostos bioativos (carotenoides, fenólicos etc.), DCNT (obesidade, síndrome metabólica, doenças cardiovasculares e câncer) e tecnologias ômicas (epigenômica, transcriptômica, proteômica, metabolômica e metagenômica). Finalmente, esta obra contempla a genômica nutricional sob a perspectiva da ética e da bioestatística, fundamentais no desenvolvimento de qualquer trabalho científico. Todos os capítulos foram escritos por pesquisadores com expertise na área, o que resultou em uma publicação de muita qualidade. Portanto, esperamos, de fato, contribuir com a literatura científica brasileira em um tema tão promissor nas Ciências da Nutrição e da Saúde. As Organizadoras

Apresentação

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As doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) se transformaram rapidamente em um grande desafio de saúde pública em nível mundial. O crescimento descontrolado de doenças como a obesidade e o diabetes impõe uma pesada carga de morbiletalidade e custos para os sistemas de saúde. O tratamento dessas enfermidades é complexo e os resultados de mundo real ainda são desanimadores. Isto se deve, em grande parte, à carência de ferramentas terapêuticas mais modernas e desenvolvidas a partir de um conhecimento mais detalhado das interações do organismo da pessoa acometida com o agente terapêutico empregado. É nesse cenário que a genômica nutricional desponta como um avanço promissor no entendimento de novos recursos diagnósticos e terapêuticos para a prevenção e o tratamento das principais doenças crônicas não transmissíveis.

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Coordenado por duas pesquisadoras com sólida formação científica e acadêmica, Helen Hermana Miranda Hermsdorff e Josefina Bressan, este livro representa uma excelente fonte de conhecimento e atualização sobre o que tem surgido de mais relevante e promissor a partir de pesquisas básicas e clínicas que vêm se desenvolvendo em ritmo acelerado nessa área. Cada um dos 24 capítulos foi redigido de forma clara e concisa, respeitando cuidadosamente os princípios do rigor científico que devem reger a preparação de um livro que, sem dúvida, vem preencher uma lacuna na produção acadêmica sobre o assunto. Walmir Ferreira Coutinho Diretor do Departamento de Medicina da Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro (PUC-Rio). Doutor em Medicina pela Universidade Federal de São Paulo (Unifesp). Ex-presidente da Federação Mundial de Obesidade.

Prefácio

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5-metil THF 5,10-metileno THF A AA ACAT ACC ADAMTS

ADIPOQ ADIPOR2 ADORA2B ADRB AFP AG AGCC AGE AGL AGMI AGPI AgRP AGS AGt AHA AIEC Akt ALA ALOX5 ALOX5AP AMPK AP-1 APC APO APOE ARC

5-metil tetraidrofolato 5,10-metileno tetraidrofolato adenina ácido araquidônico acil-CoA: colesterol aciltransferase (do inglês, acyl-CoA: cholesterol acyltransferase) acetil CoA carboxilase (do inglês, acetyl-CoA carboxylase) desintegrina e metaloproteinases com domínio trombospondinas (do inglês, disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs) adiponectina receptor 2 de adiponectina receptor de adenosina 2B receptores beta-adrenérgicos alfafetoproteína ácidos graxos ácido graxo de cadeia curta produtos finais da glicação avançada (do inglês, advanced glycation end products) ácidos graxos livres ácidos graxos monoinsaturados ácidos graxos poli-insaturados gene pepetídio agouti ácidos graxos saturados ácidos graxos trans American Heart Association adherent and invasive Escherichia coli proteína quinase B ácido graxo alfalinolênico lipoxigenase-5 proteína ativadora da lipoxigenase-5 proteína quinase ativada por Monofosfato de adenosina proteína ativadora células apresentadoras de antígeno apoproteína apolipoproteína E núcleo arqueado do hipotálamo

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ARE ARIC ASC ASPE ATAC-Seq ATP AVC AVE BGYR BN BSA BSH C C/EBP-α cAMP CaSR CAT CBA CC CCR CCR2 CD36 CDC CDK9 cDNA CDT CE CE CE-MS CETP CE-UV ChIP ChREBP

antioxidant response elements Atherosclerosis Risk in Communities proteína associada à apoptose allele specific primer extension assay for transposase-accessible chromatin-Seq trifosfato de adenosina acidente vascular cerebral acidente vascular encefálico bypass gástrico em Y de Roux binomial negativa bovine serum albumin hidrolase de sais biliares (do inglês, bile salt hydrolase) citosina do inglês, CCAAT-enhancer-binding proteins Monofosfato de adenosina cíclico receptores sensíveis ao cálcio catalase compostos bioativos circunferência da cintura câncer colorretal do inglês, C-C motif chemokine receptor 2 diferenciação 36 Centers for Disease Control and Prevention cinase dependente de ciclina 9 (do inglês, cyclindependent kinase 9) DNA complementar toxina distensora citoletal eletroforese capilar éster de colesterol eletroforese capilar com detecção por espectrometria de massas proteína de transferência de ésteres de colesterol (do inglês, cholesteryl ester transfer protein) eletroforese capilar com detecção por espectroscopia ultravioleta imunoprecipitação de cromatina (do inglês, chromatin immunoprecipitation) proteína reguladora do elemento responsivo ao carboidrato

Lista de Siglas e Abreviaturas

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CI CIMP circRNA CLA CM CNIO COBRA COX CP CpG CPI cRNA C-S Ct CT CTD CTD CYP CZE Da DAC DAG DALY DAMF CC DC DCNT DCV DGAT DHA DHRF IID DII DM DM1 DM2 DMR DMSO DNA DNA-PKcs DNMT dNTP DOBS DOHaD

cardiopatia isquêmica fenótipo metilador das ilhas de CpG moléculas circulares de RNA ácido linoleico conjugado câncer de mama Centro Nacional de Investigação Oncológicas análise combinada de bissulfito e restrição (do inglês, combined bisulfite restriction analysis) cicloxigenase câncer de próstata citosina-fosfatidil-guanina complexos de pré-iniciação RNA complementar citosina-sulfonato ciclo threshold colesterol total cauda C-terminal domínio carboxiterminal (do inglês, carboxi terminal domain) citocromos P450b eletroforese capilar de zona dálton doença arterial coronariana diacilglicerol anos de vida perdidos por incapacidade (do inglês, disability-adjusted life year) dilatação arterial mediada por fluxo corrente contínua doença de Crohn doenças crônicas não transmissíveis doenças cardiovasculares acil-CoA:diacilglicerol aciltransferase (do inglês, diacylglycerol acyltransferase) ácido graxo docosaexaenoico di-hidrofolato redutase índice inflamatório da dieta doenças inflamatórias intestinais diabetes melito diabetes melito tipo 1 diabetes melito tipo 2 região diferencialmente metilada dimetilsulfóxido ácido desoxirribonucleico proteína quinase dependente de DNA DNA metiltransferases desoxirribonucleotídeos escore do balanço oxidativo da dieta developmental origins of health and disease (origens desenvolvimentistas da saúde e da doença)

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DPA dPCR DPE DPOC DTC ECA EGFR eNOS enzimas TET EPA ERK ERN ERO ESI ESE EUP EWAS FABP FABP2 FAS FATP FCA FL FMLP FMO FTG FTO FvW G GABA GALT GC GC-FID GC-MS GEA GHRL GIP GLP-1 GOA

ácido graxo docosapentaenoico reação em cadeia da polimerase digital elemento promotor posterior doença pulmonar obstrutiva crônica testes genéticos pessoais (do inglês, direct-toconsumer tests) enzima conversora de angiotensina receptor do fator de crescimento epidérmico enzima óxido nítrico sintase endotelial enzimas ten-eleven translocation ácido graxo eicosapentaenoico proteína quinase que fosforila a proteína downstream (do inglês, extracellular signal regulated kinase) espécies reativas de nitrogênio espécies reativas de oxigênio ionização por electrospray ativadores de splicing exônicos (do inglês, exonic splicing enhancers) excreção urinária de potássio estudos de associação de genômica ampla (do inglês, epigenome-wide association studies) proteína ligadora de ácidos graxos (do inglês, fatty acid binding protein) proteína transportadora de ácidos graxos 2 ácido graxo sintase (do inglês, fatty acid synthase) proteína transportadora de ácidos graxos (do inglês, fatty acid transport protein) focos de criptas aberrantes fosfolípidios formilmetionil-leucil-fenilalanina flavina monoxigenase fatores de transcrição gerais fat mass and obesity fator de von Willebrand guanina ácido gama-aminobutírico tecido linfoide associado ao intestino cromatografia a gás cromatografia a gás com detecção por ionização em chama cromatografia a gás com detecção por espectrometria de massas genetics of atherosclerotic disease gene da grelina polipeptídio inibitório gástrico (do inglês, gastric inhibitory polipeptide) peptídio semelhante a glucagon 1 (do inglês, glucagon-like peptide 1) gordura de origem animal

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GPx GPX1 GPX4 GRK GSH GSHPx GSSG GST GWAS HAEC HAS HAT HBMEC HDAC HDL HDL-c HDLg HDLp HDM HE HELP HETE HF HIF-1 HILIC HGM-CoA HNPCC HOCl HPCE HPETE HPLC

HRO HUVEC IAM IBGE ICAM-1 IDH IDL IEF IFN-J

glicerol 3-fosfato aciltransferases (do inglês, glycerol 3-phosphate acyltransferase) glutationa peroxidase glutationa peroxidase 1 glutationa peroxidase 4 quinases reguladoras das proteínas G glutationa reduzida glutationa peroxidase selênio-dependente glutationa oxidada glutationa-S-transferase estudos de associação ampla do genoma (do inglês, genome-wide association studies) células endoteliais de aorta humana hipertensão arterial sistêmica acetiltransferase de histonas células endoteliais de medula óssea humana desacetilase de histonas lipoproteína de alta densidade colesterol da lipoproteína de alta densidade HDL grandes HDL pequenas desmetilase de histonas hipertensão essencial Hpaii tiny fragment enrichment by ligation mediated PCR hidroxieicosatetraenoico hipercolesterolemia familiar fator 1 induzido por hipóxia cromatografia a líquido de interação hidrofílica 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A CCR não polipoide hereditário (do inglês, hereditary nonpolyposis colorectal cancer) ânion cloreto em ácido hipocloroso eletroforese capilar de alto desempenho (do inglês, high-performance capillary electrophoresis) hidroxiperoxieicosatetraenoico cromatografia líquida de alta performance (do inglês, high-performance liquid chromatography) hiperemia reativa após oclusão células endoteliais de cordão umbilical humano infarto agudo do miocárdio Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística molécula de adesão intercelular 1 (do inglês, intercellular adhesion molecule 1) índice de desenvolvimento humano lipoproteína de densidade intermediária focalização isoelétrica (do inglês, isoelectric focusing) interferona gama

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IGF IgG IKKE

IL IL-1Ra IMAC

IMC IncRNA INDELS iNOS INR IP IP3 IP6 IRS-1 ISNN Iκb JNK K KoGES KSR2 LA LBP LC LCAT LC-MS

LDL LDL-c LDLmm LDLox LDLp LDLR LEP LEPR

fator de crescimento semelhante à insulina (do inglês, insulin-like growth factor) imunoglobulina subunidade beta do inibidor da quinase kappa (do inglês, inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta) interleucina antagonista do receptor de interleucina 1 coluna de imobilização por afinidade a um metal (do inglês, immobilized metal affinity chromatography) índice de massa corporal RNA longos não codificadores de proteínas inserção ou deleção óxido nítrico sintase induzida (do inglês, inducible nitric oxide synthase) elemento iniciador fosfato de inositol (do inglês, inositol phosphate) inositol trifosfato hexafosfato de inositol receptor de insulina 1 (do inglês, insulin receptor substrate 1) International Society of Nutrigenetics/ Nutrigenomics proteína inibitória kappa B (do inglês, inhibitory kappa B) proteína quinase c-Jun NH2-terminal (do inglês, c-Jun N-terminal kinase) suplementação de potássio Korean Genome and Epidemiology Study quinase supressora de Ras 2 ácido linoleico proteína de ligação de lipopolissacarídeo cromatografia a líquido lecitina:colesterol aciltransferase (do inglês, lecithin:cholesterol acyltransferase) cromatografia líquida associada à espectrometria de massa em electrospray (do inglês, liquid chromatography-electrospray mass spectrometry)/ cromatografia a líquido com detecção por espectrometria de massas lipoproteína de baixa densidade (do inglês, low density lipoprotein) colesterol da lipoproteína de baixa densidade LDL minimamente modificada lipoproteína de baixa densidade oxidada LDL pequenas receptores de LDL leptina receptor de leptina

GPAT

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Leu LHS LINE LNA LOX LPL LPL LPS LPTR LT MAG MALDI MAP MAPK MC4R MCAM MCP-1 MDA MDB MDCS MeDIP MEF2A MIF

MIP miRNA MMP MMR MnSOD MPT mRNA MS MS-FLAG MS-HRM MSI MS-MCA MSP MT MT2A MTF-1 MTHFR mTOR

leucina lipase hormônio-sensível long interspersed nuclear elements locked nucleic acid lipoxigenase lipase lipoproteica lipoproteína lipase lipopolissacarídeo lipoproteínas remanescentes leucotrienos monoacilglicerol matrix assisted laser desorption/ionization Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis proteína quinase ativada por mitógeno receptor de melanocortina 4 methylated CpG island amplification with microarray hybridization proteína quimiotática de monócitos 1 (do inglês, monocyte chemoattractant protein-1) malondialdeído domínio de proteína ligadora de metil Malmö Diet and Cancer Study methyl-DNA immunoprecipitation do inglês, myocyte-specific enhancer factor 2A migração de macrófagos/fator inibitório da migração de macrófagos (do inglês, migration inhibitory factor) primers não sensíveis à metilação micro-RNA metaloproteinases de matriz (do inglês, matrix metalloproteinases) erros de pareamento (do inglês, mismatch repair) superóxido dismutase dependente de manganês modificações pós-traducionais RNA mensageiro espectrometria de massas methylation-specific fluorescent amplicon generation methylation-sensitive high resolution melting instabilidade de microssatélites methylation-sensitive melting curve assay PCR específica para metilação (do inglês, methylation-specific PCR) metalotioneína metalotioneína 2A fator de transcrição metal-responsivo-1 (MTF-1; do inglês, metal-responsive transcription factor-1) metileno tetraidrofolato redutase alvo da rapamicina em mamíferos

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mTOR/AMPK MTR MTRR MTTP

MudPIT MV n-3/Z-3 n-6/Z-6 NADPH-oxidase NAFLD NASH NAT NCBI nCEH ncRNA NCT NF-NB NGNL NGS NHEJ NIST NK NO NPY NQO1 OMS OR PA PAD PAS PAF PAI-1 PAM PAMP PAS PBMC PC1 PCR

mammalian target of rapamycin/adenosine monophosphate-activated protein kinase metionina sintase metionina sintase redutase proteína de transferência microssomal de triglicerídio (do inglês, microsomal triglyceride transfer protein) multidimensional protein identification technology máxima verossimilhança ômega-3 ômega-6 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen oxidase doença hepática gordurosa não alcoólica (do inglês, non-alcoholic fatty liver disease) esteato-hepatite não alcoólica (do inglês, nonalcoholic steatohepatitis) N-acetiltransferases National Center for Biotechnology Information enzima colesterol éster hidrolase neutra RNA não codificantes controle negativo da reação (do inglês, no template control) fator nuclear kappa B (do inglês, nuclear factor kappa B) normoglicídica e normolipídica sequenciamento de próxima geração (do inglês, next-generation sequencing) non-homologous end-joining National Institute of Standards and Technology natural killer óxido nítrico neuropeptídio Y quinona oxidorredutase Organização Mundial da Saúde odds ratio pressão arterial pressão arterial diastólica pressão arterial sistólica fator ativador de plaquetas inibidor de plasminogênio ativado 1 pressão arterial média padrões microbianos associados a patógenos pressão arterial sistólica células mononucleares do sangue periférico (do inglês, peripheral blood mononuclear cells) pró-hormônio convertase 1 reação em cadeia da polimerase (do inglês, polimerase chain reaction)

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PDB PGC1A

PGE PGE2 PGI pI PI-3K PIR PKA PKC PKU PMF PNS POMC PONG PPAR PPARA PREDIMED PRF Pro PRR pTEFb PYY qPCR QM RAA RAGE Rap1 RAPD RDA RE Rf RFLP RI RISCK RMN

proteína C-reativa pró-proteína convertase subutilisina/quexina tipo 9 Protein Database Bank coativador 1-alfa do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (do inglês, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) prostaglandina prostaglandina E2 prostaciclina ponto isoelétrico fosfatidil-inositol-3-quinase Protein Information Resource proteína quinase A proteína quinase C (do inglês, protein kinase C) fenilcetonúria impressão digital de peptídios (do inglês, peptide mass fingerprinting) Pesquisa Nacional de Saúde pró-opiomelanocortina Orientação Nutricional Pessoal On-line (do inglês, personal online nutrition guidance) receptores ativados por proliferadores de peroxissoma proliferador de peroxissoma do tipo alfa Prevención con Dieta Mediterranea Protein Research Foundation prolina receptores de reconhecimento de padrões fator positivo de alongamento da transcrição (do inglês, positive transcription elongation factor) peptídio YY PCR quantitativa quilomícrons renina-angiotensina-aldosterona receptores AGE (do inglês, receptor advanced glycation end products) RAS-proximate-1 ou ras-related protein 1 randomly amplified polymorphc DNA ingestão dietética recomendada (do inglês, recommended dietary allowance) receptor de estrógeno radiofrequência análise de polimorfismo por fragmentos de restrição resistência à insulina Reading, Imperial, Surrey, Cambridge, and Kings ressonância magnética nuclear

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RNA RNA-Pol II RRBS rRNA RT-PCR SAM SAT SCD SDF-1 SDS SDS-PAGE

Se SECIS SELENOK SELENOP SELENOS SELENOT SERM SHMT1 SI SINE SLC19A1 SM SNC snoRNA SNP snRNA snRNP SNS SOD SREBP STAT3

STR SULT SULT1A1 T TADA TCA TCF7L2 TG

ácido ribonucleico RNA-polimerase II reduced representation bisulfite sequencing RNA ribossômico reverse transcription PCR S-adenosilmetionina gordura saturada enzima hepática estearoil-CoA dessaturase (do inglês, stearoil-CoA dessaturase) fator 1 derivado do estroma dodecil sulfato de sódio (do inglês, sodium dodecyl sulfate) eletroforese em gel de poliacrilamida em dodecil sulfato de sódio (do inglês, sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis) selênio selenocysteine insertion sequence selenoproteína K selenoproteína P selenoproteína S selenoproteína T moduladores seletivos do receptor de estrógeno serina hidroximetiltransferase 1 sensibilidade à insulina elementos nucleares intercalantes curtos (do inglês, short interspersed nuclear elements) solute carrier family 19 member 1 síndrome metabólica sistema nervoso central RNA nucleares pequenos (do inglês, small nucleolar RNA) polimorfismo de nucleotídeo único (do inglês, single nucleotide polymorphism) RNA nuclear ribonucleoproteína nuclear sistema nervoso simpático enzima superóxido dismutase sterol regulatory element-binding proteins transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 (do inglês, signal transducers and activators of transcription) simple tandem repeats sulfotransferase enzima sulfotransferase 1A1 timina Technology Assisted Dietary Assessment ácido tricarboxílico transcription factor 7-like 2 (gene) triglicerídio

PC-R PCSK9

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TGF-E1 TGI THF TLR TMA TMAO TNF TOTG TRC tRNA TS TXA TYMS U UCP UniProt

fator transformador de crescimento beta 1 (do inglês, transforming growth factor beta) trato gastrintestinal tetraidrofolato receptor do tipo Toll trimetilamina trimetilamina-N-óxido fator de necrose tumoral (do inglês, tumor necrosis factor) teste oral de tolerância à glicose transporte reverso de colesterol RNA transportador timidina sintase tromboxanos timidilato sintase uracila/uracil proteínas desacopladoras (UCP) Universal Protein Resource

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UPR U-S VCAM-1 VCT VDR VEGF VIGITEL VLDL VNTR

resposta a proteínas mal enovelada (do inglês, unfolded protein response) uracil-sulfonato molécula de adesão celular-vascular 1 (do inglês, vascular cell adhesion molecule 1) valor calórico total receptor de vitamina D fator de crescimento endotelial vascular (do inglês, vascular endothelial growth factor) Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico lipoproteína de muito baixa densidade (do inglês, very low density lipoprotein) região repetida variável (do inglês, variable number of tandem repeats)

WGA

whole genome association

Zn Zn-SOD

zinco Zn-superóxido dismutase

D-MSH

alfa-hormônio estimulador de melanócito

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1 Genoma Humano: DNA e Cromossomos .............1 Leonardo Lopes Bhering • Lidiane Aparecida Silva • Leonardo de Azevedo Peixoto

2 Do DNA à Proteína ............................................21 Leandro Licursi de Oliveira • Michelle Dias de Oliveira • Silvia Almeida Cardoso

3 Expressão Gênica: Controles Transcricional e

Pós-transcricional ..............................................37

José Luiz Marques Rocha • Ramon de Freitas Santos • Helen Hermana Miranda Hermsdorff • Josefina Bressan

4 Doenças Crônicas Não Transmissíveis no

Brasil e no Mundo .............................................57

Danielle Cristina Guimarães da Silva • Kátia Josiany Segheto • Giana Zarbato Longo

5 Inﬂamação e Estresse Oxidativo no

Desenvolvimento das Doenças Crônicas Não Transmissíveis.............................................67

Ana Paula Silva Caldas • Daniela Mayumi Usuda Prado Rocha • Helen Hermana Miranda Hermsdorff • Josefina Bressan

6 Genômica Nutricional na Perspectiva

Atual da Nutrição Personalizada .......................83

Karla Pereira Balbino • Helen Hermana Miranda Hermsdorff • Josefina Bressan

7 Da Reação em Cadeia da Polimerase

Convencional ao Microarray: Avanços Tecnológicos ......................................................99 Silvia Almeida Cardoso • Leandro Licursi de Oliveira • Josicelli Souza Crispim • Carine Ribeiro Pessoa

8 Métodos de Determinação de Marcadores

Epigenéticos ....................................................115

Júlia Cristina Cardoso Carraro • Helen Hermana Miranda Hermsdorff • Josefina Bressan

9 Nutrigenética na Ocorrência da Obesidade

e na Perda de Peso ..........................................137

Eliane Lopes Rosado • Fernanda Cristina Carvalho Mattos Magno

10 Nutrigenética na Ocorrência e no

Tratamento do Diabetes ..................................159

Thais Steemburgo

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11 Nutrigenética na Ocorrência e no

Tratamento das Doenças Cardiovasculares ......169

Aline Marcadenti de Oliveira • Melissa Medeiros Markoski

12 Nutrigenética e Câncer ....................................193 Renata Nascimento de Freitas • Priscila Oliveira Barbosa

13 Micronutrientes e Biodisponibilidade na

Perspectiva da Genômica Nutricional ..............225

Janaina Lombello Santos Donadio • Raquel Santana da Cruz • Silvia Maria Franciscato Cozzolino

14 Compostos Bioativos, Sinalização Celular

e Expressão Gênica..........................................243

Hércia Stampini Duarte Martino • Mariana Grancieri • Natália Elizabeth Galdino Alves

15 Ácidos Graxos e Expressão de Genes

Envolvidos no Metabolismo Lipídico e no Risco Cardiovascular........................................261

Ana Maria Pita Lottenberg • Maria Silvia Ferrari Lavrador • Milessa da Silva Afonso • Roberta Marcondes Machado Figueiredo

16 Ácidos Graxos e Expressão de Genes

Promotores de Marcadores Inﬂamatórios........283

Roberta de Oliveira Bernardes • André Gustavo Vasconcelos Costa • Dennys Esper Cintra

17 Programação Fetal e Doenças Crônicas

Não Transmissíveis...........................................303

Alinne Paula de Almeida • Helen Hermana Miranda Hermsdorff • Josefina Bressan

18 (Nutri)Epigenética na Obesidade e na

Síndrome Metabólica.......................................315

Lílian Lelis Lopes • Helen Hermana Miranda Hermsdorff • Josefina Bressan

19 Proteômica como Biomarcadores nas

Doenças Crônicas Não Transmissíveis ..............329

Marcelo Macedo Rogero • Daniela Fojo Seixas Chaves

20 Metabolômica e Doenças Cardiovasculares.....341 Marina Franco Maggi Tavares • Brenda Lee Simas Porto

Sumário

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21 Microbiota nas Doenças Crônicas

Não Transmissíveis...........................................357

Lisiane Lopes da Conceição • Manoela Maciel dos Santos Dias • Mariana de Moura e Dias • Nathane Pais Siqueira • Sandra Aparecida dos Reis • Maria do Carmo Gouveia Peluzio

22 Microbiota na Promoção e na Prevenção

das Doenças Intestinais ...................................371

Bruna Cristina dos Santos Cruz • Letícia De Nadai Marcon • Maria do Carmo Gouveia Peluzio

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23 Aspectos Éticos na Genômica Nutricional .......389 Carla Barbosa Nonino • Marcela Augusta de Souza Pinhel • Carolina Ferreira Nicoletti

24 Bioestatística na Genômica Nutricional ...........395 Fernando Luiz Pereira de Oliveira • Moysés Nascimento • Fabyano Fonseca e Silva • Adriano Marçal Pimenta

Índice ...............................................................401

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Genoma Humano: DNA e Cromossomos Leonardo Lopes Bhering • Lidiane Aparecida Silva • Leonardo de Azevedo Peixoto

INTRODUÇÃO Os organismos vivos, com exceção dos vírus, são constituídos por unidades básicas denominadas células. Nessas estruturas está contido o material genético que caracteriza morfológica e fisiologicamente os organismos. Os organismos eucariotos – entre eles, os seres humanos – apresentam em suas células um envoltório nuclear que circunda o material genético, formando um núcleo que o separa dos demais conteúdos celulares. Nos núcleos celulares, são encontrados os ácidos nucleicos, macromoléculas de grande importância biológica, responsáveis por armazenamento e transmissão da informação genética. Os ácidos nucleicos podem ser de dois tipos: ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). O DNA é uma macromolécula linear conhecida por sua estrutura tridimensional de duplahélice, formada por duas cadeias nucleotídicas, as quais se complementam. Os nucleotídeos que integram as cadeias da molécula de DNA são formados por um grupamento fosfato, um açúcar pentose desoxirribose e uma base nitrogenada. Nesses filamentos nucleotídicos, podem estar presentes quatro tipos de bases nitrogenadas: adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C). O DNA é o responsável pela transmissão das características genéticas entre os seres vivos mediante o processo de

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replicação, bem como o transporte da informação necessária para a síntese de proteínas por meio de transcrição e tradução. O RNA é uma molécula fundamental no processo de transcrição e tradução, responsável pela intermediação entre o DNA e a síntese de proteínas. O RNA é formado por uma fita simples de nucleotídeos, em que o açúcar de sua cadeia é a ribose e uma de suas quatro bases nitrogenadas é diferente daquelas encontradas no DNA, ou seja, no lugar da timina (T) está presente a uracila (U). Os principais tipos de RNA são: RNA mensageiro (mRNA), que codifica as proteínas; RNA transportador (tRNA), que carrega aminoácido específico para complementar a sequência de nucleotídeos do mRNA quando este está ligado ao ribossomo; e RNA ribossômico (rRNA), que constitui parte da estrutura do ribossomo, o qual, associado a diversas proteínas, permite a ligação entre dois aminoácidos na síntese proteica. Os cromossomos (kroma = cor, soma = corpo) são corpúsculos densamente corados formados por um complexo altamente condensado de uma molécula de DNA associada a uma classe especial de proteínas histonas. Esses cromossomos são transmitidos por completo da célula-mãe para as células-filhas por divisões nucleares denominadas mitose e meiose. No período da interfase, essas estruturas se encontram em seu estado menos condensado e são

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Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis

denominadas cromatina. O DNA, como parte do cromossomo, é constituído por uma série linear de nucleotídeos que determinam a informação genética, que é transmitida a cada geração, de modo que todas as células tenham o mesmo conjunto de DNA com a mesma informação contida nessa sequência de nucleotídeos. Por sua vez, os genes são definidos como as principais unidades funcionais distribuídas ao longo do DNA cromossômico, capazes de codificar proteínas. A genética molecular procura explicar como a informação hereditária se organiza e se manifesta nos organismos vivos. Os genes são constituídos de DNA e a sua expressão fenotípica ocorre na forma de moléculas de RNA, que são traduzidas em proteínas. A sequência linear de bases formada ao longo das duas cadeias nucleotídicas do DNA é definida como código genético, e é uma característica específica que distingue um gene de outro. Desse modo, o mapeamento genético consiste na identificação de cada um dos genes do cromossomo, determinando a sequência nucleotídica e sua função, enquanto o genoma é definido como o conjunto de todos os cromossomos diferentes em um organismo. Assim, o sequenciamento do genoma consiste em representar a sequência dos nucleotídeos de todos os genes presentes no organismo. Em 1980, com a colaboração de inúmeros pesquisadores de todo o mundo, foi desenvolvido o Projeto Genoma Humano, que tinha como objetivo o sequenciamento do genoma inteiro da espécie humana. Os geneticistas acreditavam que os métodos de mapeamento e sequenciamento de fragmentos de DNA eram suficientemente adequados e eficientes para a conclusão deste projeto. Inicialmente, foram estimados um tempo de 15 anos e um gasto de US$ 3 bilhões para alcançar o resultado. Desse modo, em 1990, foi iniciado o projeto público com a participação internacional de 20 grupos de pesquisa que fundaram o International Human Genome Sequencing Consortium, que

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empregava a estratégia de utilização de mapas genéticos e físicos para o sequenciamento do genoma. Em 1998, simultaneamente com o projeto público, Craig Venter direcionou as pesquisas da empresa particular Celera Genomics para o sequenciamento do genoma humano. Venter propôs a utilização do método shotgun, o qual consiste no sequenciamento de clones criados a partir de pequenas inserções preparados diretamente do DNA genômico. Em 2000, 5 anos antes do previsto, ambos os projetos apresentaram o esboço do genoma incluindo grande parte da sequência do genoma humano. Em 2003, foram divulgados os resultados desse projeto, com 99% do genoma humano sequenciado e com precisão de 99,99%. Tornou-se conhecida a sequência completa do genoma humano, com seus 23 cromossomos e 3,2 bilhões de pares de bases. Por sua vez, 24.000 genes estão distribuídos ao longo da molécula de DNA, em que cada gene tem tamanho médio de aproximadamente 27.000 pares de bases. A maior parte do DNA é formada por regiões não codificantes, visto que apenas 25% do DNA é transcrito em mRNA e menos de 2% codifica proteínas. Um único gene é capaz de codificar em média dois ou três mRNA, podendo codificar até 72.000 mRNA e múltiplas proteínas. Os cromossomos humanos apresentam densidade gênica variada. As mais altas densidades são observadas nos cromossomos 17, 19 e 22 e as mais baixas, nos cromossomos X, Y, 4, 13 e 18. Os mamíferos em geral apresentam genomas muito parecidos; por exemplo, a sequência de bases em humanos pouco difere da sequência do genoma de orangotangos e chimpanzés. Assim, o sequenciamento genético dos primatas facilita os estudos sobre a evolução humana. Vários seres vivos já têm seu DNA mapeado; genomas inteiros de mais de 3.800 outras espécies já foram sequenciados e analisados. Os estudos do sequenciamento do DNA de outros seres vivos são muito

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importantes para ajudar a compreender sobre o DNA humano. Contudo, o genoma humano codifica inúmeras proteínas não codificadas por outros animais, como as que afetam sistema imunológico, desenvolvimento, estrutura e funcionamento neural, vias de sinalização intracelular e intercelular no desenvolvimento, hemostasia e apoptose. A descoberta do genoma humano, bem como a posição de cada gene e de sua composição, é um grande avanço para os estudos da saúde humana. Essas informações genômicas apresentam grandes aplicações na biomedicina, podendo ser utilizadas de forma consciente para prevenção, diagnóstico, tratamento e até a cura de muitas doenças que tenham fatores genéticos envolvidos, tais como obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares e câncer. Por exemplo, com o conhecimento e a identificação de uma dada proteína que não é produzida de forma eficiente no corpo humano, é possível tratar ou prevenir algumas doenças antes mesmo que elas se manifestem, suprindo as necessidades do corpo de forma artificial. O investimento nos estudos envolvendo o conhecimento do código genético humano pode ocorrer em várias linhas, a saber: ■ Farmacogenômica. ■ Terapia gênica. ■ Genômica nutricional. ■ Estudos de envelhecimento. ■ Biologia regenerativa. ■ Clonagem. ■ Reprodução e muitas outras.

ESTRUTURA DO ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO O DNA é uma macromolécula encontrada em todos os organismos vivos. Foi descoberta pelo bioquímico alemão Friedrich Miescher em 1869, que notou um composto de natureza ácida, rico em fósforo e em nitrogênio nos núcleos celulares, denominado nucleína. Em

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1880, Albrecht Kossel demonstrou a presença de bases nitrogenadas na nucleína, explicando sua estrutura rica em nitrogênio. Richard Altmann, em 1889, obteve a nucleína com alto grau de pureza, confirmando sua estrutura ácida e renomeando essa macromolécula como ácido nucleico. Além dos citados, muitos pesquisadores como Avery, MacLeod, McCarty, Levene e Chargaff contribuíram ao longo dos anos para definir as funções e a composição dos ácidos nucleicos, bem como especificamente da molécula de DNA. O DNA é constituído por um grande número de unidades ligadas denominadas nucleotídeos, em que cada uma dessas unidades é composta por um açúcar, uma base nitrogenada e um grupamento fosfato. O açúcar constituinte dos nucleotídeos é a pentose desoxirribose e as bases nitrogenadas são encontradas nessa molécula em quatro diferentes formas: adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G) (Figura 1.1). Para definir a estrutura da molécula de DNA, vários pesquisadores reconheceram que o material genético deveria apresentar três características fundamentais: capacidade de armazenar a informação genética complexa e variável, replicar e transmitir essa informação fielmente aos seus descendentes e traduzir essa informação no fenótipo dos organismos. Em 1953, James Watson e Francis Crick, com base em todas as informações sobre a química do DNA investigadas pelos pesquisadores que os antecederam, propuseram um modelo tridimensional do DNA que representou um dos maiores marcos na história da biologia (Figura 1.2).1 De acordo com o modelo proposto, uma molécula de DNA é composta por duas fitas longas de nucleotídeos, que se enrolam uma em torno da outra, formando uma dupla-hélice com giro para a direita. Em cada fita, as desoxirriboses são ligadas por meio de interações químicas aos grupamentos fosfato, formando uma cadeia principal, que fica externa em relação às bases nitrogenadas, semelhante a um corrimão

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Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis NH2

O C

N C

H2N

Guanina (purina)

Citosina (pirimidina) O

NH2 C

N H

Adenina (purina)

Figura 1.1

CH N

CH3

N C

CH N

C O

C N

H Timina (pirimidina)

Representação química das bases nitrogenadas constituintes dos nucleotídeos

Purinas: guanina e adenina representadas por dois anéis aromáticos em suas estruturas; pirimidinas: citosina e timina representadas por um anel aromático em suas estruturas.

de uma escada em espiral. Nesta cadeia de açúcar-fosfato estão fixadas as bases nitrogenadas voltadas para dentro. Assim, cada base de uma fita se liga a uma base complementar da fita oposta por meio de atrações químicas fracas, denominadas pontes de hidrogênio, representando os “degraus” da escada e garantindo a manutenção da estrutura de dupla-hélice da molécula.2 As cadeias extremas de cada filamento da dupla-hélice são formadas por unidades alternadas de fosfato (PO–4) e açúcar desoxirribose (2’-desoxi-D-ribose) conectadas por ligações fosfodiéster. Essas ligações são estabelecidas entre o grupamento fosfato de um nucleotídeo (5’-PO4) e o grupamento hidroxílico do carbono

Figura 1.2 Representação do modelo dupla-hélice tridimensional da molécula de DNA proposto por Watson & Crick (1953)

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3’ da pentose do nucleotídeo adjacente (3’OH). Essa interação confere à molécula de DNA uma propriedade importante, que é a direcionalidade. Dessa maneira, as cadeias de açúcarfosfato dos dois filamentos complementares apresentam polaridade inversa e são ditas antiparalelas, ou seja, as ligações fosfodiéster de uma cadeia vão de um carbono 5’ de um nucleotídeo a um carbono 3’ do nucleotídeo adjacente, enquanto, no filamento complementar, seguem de um carbono 3’ para um carbono 5’, em um sentido unidirecional ao longo da molécula de DNA (Figura 1.3).3 Em um filamento da dupla-hélice, as bases nitrogenadas são conectadas às desoxirriboses por ligações glicosídicas, sendo uma base para cada açúcar. Essas ligações em uma fita não estão exatamente opostas às ligações da fita complementar, de modo que são formadas duas cavidades desiguais na dupla-hélice quando ocorre a união desses filamentos, conhecidas como cavidade maior e cavidade menor. Nessas cavidades, principalmente na maior, as bases estão expostas ao meio solvente e são quimicamente distinguíveis, podendo assim ser

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1 3'

5' O

O P O

N 5'

T N

N A

3' 4'

4' 3'

CH2

5' CH2 O O

O P O O

N N C

G N

CH2 O

O O

CH2 O O P O O

N T

A N

O O CH2

O O

CH2

O O

O O O

C N

CH2 N G

N O

CH2

3 Figura 1.3 Representação da estrutura química da molécula de DNA. Duas pontes de hidrogênio entres as bases adenina (A) e timina (T) (1); três pontes de hidrogênio entre as bases guanina (G) e citosina (C) (2); dois filamentos externos antiparalelos constituídos por ligações fosfodiéster entre pentoses e os grupamentos fosfato (3)

identificadas por moléculas que interagem com sequências específicas de bases sem o rompimento da estrutura de dupla-hélice. A maioria das interações DNA-proteínas ocorre nas cavidades maiores. As bases nitrogenadas são caracterizadas por dois tamanhos estruturais, as pirimidinas (C e T), que são compostas por um anel aromático, e as purinas (A e G), que apresentam dois anéis aromáticos. Para união das duas fitas, o

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pareamento sempre ocorre entre uma base púrica e uma pirimídica devido à complementaridade da forma e da carga. Essas bases, em suas configurações estruturais comuns, são conectadas por duas pontes de hidrogênio entre A e T e três pontes de hidrogênio entre C e G. Nesse sentido, a partir do conhecimento de um dos filamentos da dupla-hélice da molécula de DNA, é possível prever a sequência nucleotídica do filamento complementar. Essa complementaridade dos filamentos da dupla-hélice do DNA é uma propriedade que garante o armazenamento adequado e a transmissão da informação genética de geração a geração.4 Os pares de bases no DNA são estruturas planares achatadas que se empilham umas sobre as outras na região central da dupla-hélice. Os dois pares de bases formados apresentam aproximadamente o mesmo tamanho e dimensões semelhantes, ocupando o mesmo espaço tridimensional, o que mantém a uniformidade ao longo da molécula de DNA. Os anéis aromáticos dos pares de base são relativamente apolares e ficam orientados para o interior da dupla-hélice, quase perpendiculares ao eixo. Em solução aquosa, essa força de empilhamento entre as bases adjacentes forma um centro hidrofóbico que exclui as moléculas de água dos espaços entre os pares de base e, juntamente com o grande número de ligações de hidrogênio entre os pares de bases, garante a estabilidade das moléculas de DNA presentes nos protoplasmas aquosos das células vivas. A estrutura helicoidal do DNA depende totalmente do pareamento e empilhamento dos pares de base, visto que apenas um filamento de um DNA não apresentaria essa estrutura. O dogma central da genética molecular é definido como as funções mais importantes do DNA: replicação, transcrição e tradução. A replicação e a transcrição ocorrem no núcleo e a tradução ocorre no citoplasma celular. A replicação consiste na capacidade de uma molécula de DNA dar origem a duas moléculas, de forma

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Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis

semiconservativa, em que cada uma delas apresenta um filamento da molécula de DNA original. A transcrição é a passagem da informação genética do DNA para uma fita unifilamentar de mRNA, que é levada do núcleo para o citoplasma celular. No citoplasma ocorre a tradução, que consiste na síntese proteica a partir da informação genética trazida do DNA pelo mRNA (Figura 1.4). Os segmentos de nucleotídeos no DNA que contêm a informação genética são denominados genes. Esses segmentos de centenas ou até milhares de pares de bases podem ser transcritos em mRNA e codificados em proteínas. A maior parte do genoma humano não contém informação genética, e apenas 3% são formados por genes. Nos genes, as sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína são chamadas de éxons; estes, no entanto, são intercalados por sequências não codificantes, chamadas de íntrons. Os íntrons são regiões transcritas em mRNA no núcleo, mas não estão presentes no mRNA no citoplasma e, consequentemente, não originam o produto proteico final. As proteínas são polímeros constituídos de subunidades de 20 aminoácidos diferentes, em que cada aminoácido é formado por três nucleotídeos. Como o DNA é formado por quatro tipos de nucleotídeos (A, T, C e G), um código tríplice é a menor unidade de codificação capaz

DNA

Transcrição

de acomodar os 20 aminoácidos diferentes que ocorrem nas proteínas. Assim, define-se como códon a sequência de três nucleotídeos adjacentes transcrita do DNA para o mRNA capaz de codificar um aminoácido. O código genético é representado por 64 códons mRNA (43), em que 61 códons codificam aminoácidos e três indicam a terminação da cadeia polipeptídica. Esse código é dito universal, pois cada códon codifica o mesmo aminoácido em qualquer organismo.

ASSOCIAÇÃO DNA-HISTONAS O material genético dos eucariotos está representado pela cromatina nos núcleos das células interfásicas; assim, a cromatina representa os cromossomos em uma estrutura descondensada. A cromatina é conhecida por apresentar uma parte nucleica formada pelo DNA que carrega a informação genética e uma parte proteica constituída principalmente pelas proteínas histonas. A cromatina é responsável pelo empacotamento da macromolécula de DNA, visto que estas são cadeias nucleotídicas muito longas e devem estar altamente condensadas para se ajustarem ao conteúdo celular. Por exemplo, o menor cromossomo humano tem aproximadamente 14.000μm de comprimento e é 280 vezes mais longo que o diâmetro de

RNA

Tradução

Proteínas

Replicação Núcleo

Citoplasma

Figura 1.4

Representação do dogma central da genética molecular em uma célula eucariótica

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Os LINE humanos consistem em três famílias LINE-1, LINE-2, LINE-3, que correspondem a 20% de todo genoma. Dentre essas famílias, o LINE1, que corresponde a uma fração de 17% do DNA genômico, é o único que se transpõe ativamente. A maquinaria de LINE-1 é responsável pela maioria da transcrição reversa do genoma, permitindo a retrotranscrição de SINE e também de cópias de mRNA, originando pseudogenes processados e retrogenes. Ao contrário dos LINE, os SINE não codificam proteínas e são incapazes de transposição independente.

ORIGENS DA REPLICAÇÃO A replicação do DNA de organismos eucariotos é o processo de duplicação de todo o genoma para formação de novas células, a partir da divisão celular, com o conteúdo genético idêntico ao da célula-mãe. Esse processo ocorre no núcleo celular, em que o DNA é duplicado de forma eficiente, considerando a complementaridade e o antiparalelismo dos filamentos duplos, garantindo que o mesmo material genético esteja presente em todas as células do organismo. A replicação é caracterizada como semiconservativa, pois cada filamento da duplahélice do DNA serve como molde para a síntese de uma nova molécula. Além disso, outras características fundamentais da replicação são: o aumento da cadeia com adição de nucleotídeos ocorre sempre no sentido 5’ para 3’ em cada fita molde e o processo se inicia em sequências nucleotídicas específicas denominadas origens de replicação. A maioria das informações sobre a replicação foi obtida a partir de estudos realizados com Escherichia coli, que é um organismo procarioto constituído de um único cromossomo circular, formado por 4,6 milhões de pares de bases e capaz de se dividir a cada 20min a uma velocidade de 1.000 nucleotídeos por segundo. Atualmente, o processo de replicação do DNA nas células eucariotas é menos conhecido, mas

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é possível entender sobre esse processo nos organismos superiores, inclusive na espécie humana, a partir das informações obtidas pelos estudos realizados com procariotos. Há muitas evidências sobre a similaridade em alguns aspectos desses processos de replicação; no entanto, em procariotos, a replicação ocorre durante todo o ciclo celular e existe apenas uma única origem de replicação. Os cromossomos lineares dos eucariotos são muito longos e constituídos de uma extensa molécula de DNA que deve ser replicada rapidamente no período da interfase, antes do início da divisão celular. Deste modo, é reconhecido que seria impossível ocorrer todo o processo de replicação a partir de uma única origem, evidenciando a existência de inúmeras origens de replicação ao longo da molécula de DNA de células eucariotas. Essas origens de replicação são facilmente observáveis na microscopia, como sequências de nucleotídeos que formam sítios específicos. Visto que a dupla-hélice de DNA é conhecida por sua alta estabilidade, apenas em temperaturas elevadas (próximo a 1.000ºC), as pontes de hidrogênio podem ser rompidas para que os filamentos complementares consigam se separar. Assim, as sequências das origens de replicação são identificadas por unidades repetidas dos pares de base adenina e timina (A = T), que se formam por duas ligações de hidrogênio e, por isso, podem se romper com maior facilidade. O número das origens de replicação ao longo do DNA varia de acordo com a complexidade do genoma do organismo. A replicação de um cromossomo humano com aproximadamente 100 milhões de pares de bases, a uma velocidade de 5.000 nucleotídeos por minuto, partindo de uma única origem de replicação, levaria cerca de 7 dias. No entanto, sabemos que o tempo de replicação em células humanas é de minutos ou horas; então, para isso, é necessário que haja milhares de origens de replicação agindo simultaneamente ao longo

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16 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis dos cromossomos. O genoma humano é representado por 23 cromossomos, que são formados por longas macromoléculas de DNA linear. Para realização do processo de replicação, são distribuídas nesses cromossomos – a intervalos de 30.000 a 300.000 pares de bases – aproximadamente 10.000 origens de replicação. Isso possibilita que a replicação do DNA se inicie, ao mesmo tempo, em vários pontos dos cromossomos, tornando o processo rápido e eficiente. Considerando que o genoma humano é replicado a partir de milhares de origens de replicação em alta velocidade, esse processo deve ser extremamente preciso e organizado para que ocorra uma única replicação por ciclo celular, garantindo que todos os genes sejam replicados uma única vez. Para realização do processo de replicação do DNA, é necessária a atuação de várias proteínas com funções específicas. Os replissomos são definidos como todo o complexo enzimático capaz de realizar a replicação de forma eficiente e precisa, também conhecidos como maquinário de replicação. Apesar de a identificação dos constituintes dos replissomos em eucariotos ainda não estar concluída, acredita-se que esses complexos proteicos sejam formados principalmente pelas seguintes 5'

enzimas: helicase, girase, primase, DNA-polimerase I, DNA-polimerase III e ligase. Para inicializar o processo de replicação, um fator de liberação da replicação se liga a uma origem, e esse fator é um complexo denominado Mcm (de manutenção de minicromossomo), que contém a enzima helicase, a qual é a responsável pela deselicoidização de um trecho curto de DNA a partir da origem de replicação. A dupla-hélice se desfaz para que as bases sejam expostas e cada fita sirva de molde para formação das novas fitas complementares. A separação progressiva das duas fitas do DNA nas origens de replicação é promovida pelo menos por duas enzimas – a helicase e a girase –, formando as forquilhas de replicação que deixam um pequeno número de bases expostas e permitem a replicação uni e bidirecional (Figura 1.9).8 No processo unidirecional, o replissomo parte da origem e a replicação segue em um sentido. Já na replicação bidirecional, dois replissomos partem de origens em sentidos opostos. No genoma humano, em que existem milhares de origens de replicação, as forquilhas de replicação que seguem bidirecionalmente podem se fundir, formando as bolhas de replicação. Os nucleotídeos complementares entram

Helicase + girase

Helicase + girase 3'

Primer

3' 5'

Síntese da fita contínua

Síntese da fita descontínua

Primase sintetiza os primers iniciadores e DNA polimerase III inicia a síntese

Figura 1.9 interior

3' 5' Síntese da fita contínua

3' 5' Síntese da fita descontínua

Ligase une os fragmentos de Okazaki e DNA polimerase I remove os primers iniciadores

Esquema representativo da forquilha de replicação e das atividades enzimáticas realizadas no seu

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Métodos de Determinação de Marcadores Epigenéticos Júlia Cristina Cardoso Carraro • Helen Hermana Miranda Hermsdorff • Josefina Bressan

INTRODUÇÃO Há uma variedade de definições a respeito do termo epigenética que, no entanto, podem ser resumidas como uma série de modificações covalentes no DNA ou estruturas a ele associadas (RNA, proteínas), sem alterações em sua sequência primária de bases nucleotídicas, que resultam em alterações e regulação da expressão gênica.1 As alterações epigenéticas mais estudadas são a metilação de DNA, as alterações de histonas e os RNA não codificantes. Tais alterações são precisamente reguladas e consideradas estáveis e herdáveis; no entanto, exibem um caráter dinâmico e suscetível a influências ambientais, como a dieta, resultando em padrões relacionados ao maior ou menor risco de diversos tipos de doenças.2,3 Nesse sentido, a versatilidade do epigenoma frente a modificações ambientais, especialmente à ação de diversos nutrientes da dieta, e sua associação ao risco de doenças levantam a possibilidade de estratégias nutricionais de prevenção e de tratamento personalizado em reconhecimento de uma promissora temática: a epigenômica nutricional.4 Diante das intrigantes possibilidades prognósticas e terapêuticas, a busca por biomarcadores epigenéticos é emergente, e se torna

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imprescindível a escolha de melhores ferramentas e métodos de determinação dos marcadores epigenéticos. De fato, diversas técnicas têm sido descritas em pesquisas epigenéticas, principalmente no que se refere ao estudo da metilação do DNA. Essas técnicas são normalmente classificadas quanto ao pré-tratamento, se necessário, e ao método de biologia molecular seguinte empregado na detecção das citosinas metiladas. Dessa forma, uma infinidade de combinações é possível, com diferentes peculiaridades, tais como grau de sensibilidade, acurácia e rendimento.5,6 Sendo assim, este capítulo não tem como objetivo esgotar o número de possibilidades analíticas, mas descrever as técnicas mais utilizadas em genômica nutricional, bem como suas vantagens, desvantagens e aplicações a cada objetivo.

TÉCNICAS DE DETERMINAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE METILAÇÃO E HIDROXIMETILAÇÃO DO DNA A metilação da citosina na posição 5’ do anel pirimidínico é a mais importante e mais estudada alteração epigenética em mamíferos.7,8 A maioria das citosinas metiladas ocorre em dinucleotídeos CpG, os quais, quando densamente

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116 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis localizados em regiões do genoma, dão origem às ilhas CpG, cuja hipermetilação está associada à menor expressão deste gene.9 Por outro lado, a hidroximetilação do DNA está normalmente associada a maior transcrição gênica, embora careça de mais estudos.8,10 Moléculas de 5-hidroximetilcitosina são formadas como intermediárias no processo de demetilação do DNA pelas enzimas ten-eleven translocation (enzimas TET).11 Até o momento, poucos são os métodos de determinação em epigenética capazes de distinguir entre 5-metilcitosinas e 5-hidroximetilcitosinas, e os mesmos diferem quanto ao pré-tratamento do DNA e quanto à abrangência de detecção.6

Métodos de pré-tratamento do DNA A enzima DNA-polimerase não distingue citosinas metiladas de não metiladas, de modo que, para que tais modificações epigenéticas sejam discriminadas, é necessária a utilização de técnicas de pré-tratamento do DNA, sendo as mais comuns o tratamento por bissulfito de sódio, a restrição enzimática e a purificação por afinidade.5,6 O tratamento por bissulfito é o método mais comumente utilizado e considerado padrãoouro. O mesmo consiste na desaminação de citosinas não metiladas em uma fita simples de DNA, convertendo-as em uracil, ao passo que as metiladas permanecem intactas.12 A desnaturação do DNA é uma etapa prévia necessária para que a conversão seja completa, uma vez que apenas as citosinas metiladas em fitas simples são suscetíveis à conversão. Sendo assim, fitas simples de DNA passam por três etapas que culminam na conversão da citosina não metilada em uracil, sendo: ■ Sulfonação: adição de bissulfito à dupla ligação 5-6 da citosina, resultando em citosinasulfonato. ■ Desaminação hidrolítica: retirada do grupamento amino, resultando em uracil-sulfonato. ■ Dessulfonação alcalina: remoção do grupo sulfonato por tratamento com álcali, resultando na formação de uracil.

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Dessa forma, após a amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR), citosinas metiladas são convertidas em timina, ao passo que as não metiladas permanecem como citosinas, de forma que métodos subsequentes de discriminação se baseiam na relação citosina/timina (Figura 8.1). Métodos com base na conversão por bissulfito permitem a identificação do grau de metilação em um único CpG, sendo opções de análises em larga escala.14 No entanto, apresentam como limitação a possibilidade de desnaturação parcial do DNA, reduzindo a capacidade de conversão; a conversão incompleta de citosinas não metiladas em uracil; e a degradação do DNA, necessitando assim de quantidades maiores de DNA genômico.7 Pré-tratamentos com base em enzimas de restrição consistem na utilização de pares de endonucleases, em que uma isoenzima cliva o DNA apenas se o alvo for uma citosina não metilada e outra de maneira não sensível à metilação. O par de endonucleases mais utilizado é o Hpa II/Msp I, em que ambas as enzimas clivam a sequência-alvo CCGG (citosina-citosina-guanina-guanina), mas Hpa II não é capaz de clivar o DNA se a segunda citosina for metilada.15 Após a restrição enzimática, os fragmentos podem ser identificados por técnicas comuns de biologia molecular, como Southern blot ou PCR, consistindo em métodos simples e rápidos. No entanto, apresenta como limitações os fatos de requerer o conhecimento da sequência do DNA, e de que a análise de metilação só pode ser realizada dentro do sítio reconhecido pela enzima.5,6 Por fim, os métodos de purificação por afinidade se baseiam na imunoprecipitação de DNA genômico com anticorpos específicos para citosinas metiladas, sendo úteis para análises de regiões densamente metiladas.16 Tais métodos também podem ser utilizados para análises in situ, possibilitando identificação célula a célula, mesmo em populações heterogêneas, devendo, no entanto, ser previamente validados com um

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5'...GTACGAAATCACGTCATGGTTACGCCATCG...3' 3'...CATGCTTTAGTGCAGTACCAATGCGGTAGC...5' M

Desnaturação M

5'...GTACGAAATCACGTCATGGTTACGCCATCG...3' 3'...CATGCTTTAGTGCAGTACCAATGCGGTAGC...5' M

5'...GTACGAAATTACGTTATGGTTACGCCATTG...3'

5'...CATGCTTTAATGCAATACCAATGCGGTAAC...3'

Conversão por bissulfito (B)

5'...GTACGAAATUACGTUATGGTTACGCCATUG...3' Amplificação por PCR

3'...UATGCTTTAGTGCAGTAUUAATGCGGTAGU...5' 3'...ATACGAAATCACGTCATAATTACGCCATCA...5' 3'...TATGCTTTAGTGCAGTATTAATGCGGTAGT...5'

Conversão por bissulfito NM2

C O

NM2 NaHSO3

OH–

Sulfonação

NH+ 4 M 2N

C-S N

U-S

H2 O SO3

Desaminação hidrolítica

SO3

NaHSO3

Dessulfonação alcalina

(A e B) Método de pré-tratamento do DNA com bissulfito de sódio. Círculos sólidos representam Figura 8.1 citosinas metiladas e círculos vazios, citosinas não metiladas PCR: reação em cadeia da polimerase; C: citosina; C-S: citosina-sulfonato; U: uracil; U-S: uracil-sulfonato. Fonte: adaptada de Patterson et al., 2011.13

controle em termos de acessibilidade do anticorpo ao DNA.7,17 Outro método de modificação do DNA consiste na reação com hidrazina e permanganato, na qual a hidrazina reage com citosinas ou timinas, mas não reconhece citosinas metiladas, e o permanganato reage com metilcitosinas e timinas. Esses nucleotídeos modificados podem ser removidos com piperidina, e então determinados por diversos métodos de sequenciamento. No entanto, essa técnica possui baixa sensibilidade e resolução, além de exigir métodos posteriores dispendiosos, sendo assim, ocasionalmente utilizada.18-20

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Métodos de detecção de citosinas metiladas e não metiladas Os métodos de detecção de DNA metilado variam conforme o pré-tratamento do DNA empregado e conforme a abrangência de detecção (metilação global, locus-específica, in situ ou de todo o genoma). A maioria dos métodos de detecção de citosinas metiladas, após tratamento com bissulfito, baseia-se em PCR quantitativa (qPCR), sendo diferenciados quanto ao tipo de primer utilizado ou quanto à resolução desejada.

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118 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis Quanto ao tipo de primer empregado na detecção, as técnicas podem ser classificadas em PCR independente de metilação (MIP, do inglês, methylation-independent PCR), nas quais os primers são desenhados para amplificação proporcional de DNA metilado e não metilado; ou PCR específica para metilação (MSP, do inglês methylation-specific PCR), cujo primer é específico para a região metilada, o que confere maior especificidade analítica.5 As principais técnicas MIP são sequenciamento genômico por bissulfito, pirossequenciamento, COBRA, MS-SnuPE, HRM, espectrometria de massas – MALDI-TOF e Heavymethyl; enquanto as principais técnicas MSP são MS-PCR, MethyLight, SYBR® Greenbased, SMART-MSP e MS-FLAG. Por outro lado, no que se refere à abrangência da detecção, métodos com base em conversão por bissulfito podem ser de abrangência global de DNA (MSP e HRM, com primers desenhados para sequências repetitivas do genoma, como long interspersed element-1 – LINE-1, e Alu); locus-específica, com primers desenhados para genes de interesse (MSP, MethyLight, SMART-MSP, HRM, MS-SnuPE e pirossequenciamento); ou genômica (com base em microarranjos ou em sequenciamento de nova geração). Nos métodos de detecção após restrição enzimática, os fragmentos podem ser identificados por técnicas comuns de biologia molecular, como Southern blot ou PCR, consistindo em métodos simples e rápidos. Assim como os métodos fundamentados na conversão por bissulfito, estes também diferem quanto à abrangência da informação produzida, sendo os mais comuns: HPLC, HPCE, LC-MS e LUMA para análises de metilação global do DNA; Hpa II-PCR, MS-MLPA, COBRA e MS-FLAG para análises de genes específicos; e adaptações com base em microarranjos e sequenciamento de nova geração (DMH, MCAM, HELP, CHARM, MMASS, Methyl-Seq, MSCC, HELP-Seq, entre outros) para análises de genoma completo.5,6

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Já no que se refere aos métodos de detecção após purificação por afinidade, em seguida à imunoprecipitação de regiões metiladas, a detecção pode ocorrer com base na utilização de radioisótopos; fluoróforos, ou em métodos quantitativos, sendo os mais utilizados o método de ELISA, para análises globais; e adaptações quantitativas ou semiquantitativas com amplificação por PCR (MeDIP-PCR) para estudos de genes específicos. Tais adaptações ainda podem ser seguidas de detecção por microarranjo (MeDIP-chip) ou sequenciamento de nova geração (MeDIP-Seq), para análises genômicas.6

Sequenciamento direto por bissulfito (BS-Seq) O sequenciamento após a conversão por bissulfito é a forma mais direta de detecção de citosinas metiladas. Após o pré-tratamento, duplas fitas de DNA do fragmento de interesse são novamente obtidas pela amplificação por PCR, e o conteúdo de metilcitosinas pode ser obtido pelo sequenciamento padrão dos produtos desta PCR. O sequenciamento direto consiste em uma média do conteúdo de metilcitosinas nos produtos da amplificação. No entanto, a clonagem desses produtos em plasmídeos, seguida do sequenciamento desses clones, constitui uma alternativa que possibilita a avaliação de uma única molécula de DNA.21,22 Esse método era tradicionalmente considerado o padrão-ouro para a detecção de citosinas metiladas, uma vez que permite a detecção do grau de metilação em CpG individuais, ou seja, os resultados não são expressos em percentual de metilação da região total analisada, senão na metilação de cada citosina presente na sequência.12 No entanto, sua utilização para sequenciamento de clones é demasiadamente demorada e cara, dificultando sua utilização de rotina.23 Sequenciadores digitais, sem a necessidade de procedimentos de clonagem, têm facilitado tal processo.24 Outras modificações também foram sugeridas para os métodos de sequenciamento, como sua combinação a métodos de detecção por fluorescência, em

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análises de genoma completo), melhorando sua sensibilidade e se tornando um método de alta precisão.5 Essa técnica é baseada no pré-tratamento com bissulfito e consiste na detecção de pirofosfato. Durante a síntese da fita complementar de DNA pela enzima DNA-polimerase, uma molécula de pirofosfato é liberada à medida que cada nucleotídeo é incorporado à sequência, de maneira complementar à sequência estudada. O pirofosfato é então convertido em trifosfato de adenosina (ATP) pela enzima ATP sulforilase, servindo como energia para a oxidação de luciferina e geração de luz27 (Figura 8.2). Esse método também determina a metilação individual de CpG, mas não necessita de amplificação por qPCR e passou a ser considerado um método padrãoouro na detecção de metilação de DNA.6 Contudo, é ainda um método caro e sua acurácia diminui com a distância entre o dinucleotídeo CpG e a terminação 3’ do primer direto.7

que cada nucleotídeo é marcado com um distinto fluoróforo, ou ainda pela direta identificação de citosinas metiladas por extensão com uma mistura de nucleotídeos (apenas desoxiadenosina trifosfato [dATP], desoxicetidina trifosfato [dCTP] e desoxitimidina trifosfato [dTTP]), na qual os produtos de alongamento são interrompidos nos pontos de metilação, diminuindo a possibilidade de falso-positivos, em comparação com as sequências de referência.25,26 O sequenciamento direto por bissulfito foi historicamente o primeiro método de determinação de DNA metilado e, aliado a técnicas digitais, permanece uma boa opção em estudos em nível de genoma total, descrito adiante.

Pirossequenciamento O pirossequenciamento surgiu como uma alternativa para análises em larga escala ao sequenciamento de Sanger (descrito em métodos de

5'...GTACGAAATCACGTCATGGTTACGCCATCG...3' Conversão por bissulfito

5'...GTACGAAATUACGTUATGGTTACGCCATUG...3' Luciferina

Oxiluciferina

Pirossequenciamento

5'... G T A C G A A A T U A C G ...3'

C A AG C C A T T G

Luciferase

ATP

dNTP

LUZ

Pirofosfato

C 5'... G T A C G A A A T U A C G ...3'

Luz

DNA polimerase

Pirofosfato

Sulforilase

ATP

Tempo

Detecção

Figura 8.2

Representação esquemática do método de pirossequenciamento

ATP: trifosfato de adenosina; dNTP: desoxirribonucleotídeos.

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COBRA O método de análise combinada de bissulfito e restrição (COBRA, do inglês combined bisulfite restriction analysis) consiste na detecção de alvos para restrição por endonucleases, após a conversão da sequência pelo método de bissulfito.28 Os produtos de amplificação de um gene de interesse são modificados pelo método de bissulfito e então digeridos com enzimas de restrição capazes de distinguir sequências metiladas e não metiladas, de forma que a clivagem do DNA só ocorre em regiões metiladas e proporcionalmente ao grau de metilação. Os produtos da clivagem são separados em géis de agarose ou poliacrilamida e hibridizados com oligonucleotídeos marcados (que não devem conter CpG), podendo ser quantificados por revelação. Embora esse método quantitativo apresente boa sensibilidade, alta acurácia e tenha bom custo-benefício, tem como limitação o fato de ser demorado, sendo utilizado apenas em sequências reconhecidas pelas enzimas de restrição. Outro inconveniente é que algumas enzimas podem superestimar o grau de metilação, em caso de conversão incompleta por bissulfito.5,7

MS-SnuPE Methylation-sensitive single-nucleotide primer extension assay (MS-SnuPE) é uma técnica de análise de metilação que combina a conversão por bissulfito e a amplificação por primers não sensíveis à metilação (MIP) para a região de interesse, em que os produtos são isolados por eletroforese em gel e anelados novamente com um primer interno cuja porção 5’ termina exatamente no nucleotídeo que se deseja determinar (citosina metilada). Esse primer interno é alongado pela DNA-polimerase, que utiliza como substrato dCTP ou dTTP marcados com fósforo (P32). O grau de metilação pode ser então quantificado por meio da incorporação dos dNTP radioativos, obtida pela revelação dos géis de

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separação. As bandas geradas pela incorporação de dCTP correspondem às citosinas metiladas e as de dTTP, às citosinas não metiladas. Os primers internos, idealmente, não devem se anelar às sequências que originalmente continham os CpG, de forma a evitar vieses de interpretação; no entanto, essa premissa se torna difícil de ser alcançada em regiões densas em CpG. Esse método apresenta boa sensibilidade, alta acurácia, necessita de pequenas quantidades de DNA e permite a análise de quase todo o DNA, inclusive análises multiplex. No entanto, além da dificuldade já citada de detecção em regiões densas em CpG, a utilização de radioatividade também é um inconveniente do método.5,7,29,30

MS-HRM A técnica methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM) é um método quantitativo, com base em PCR, inicialmente desenvolvido para a detecção de polimorfismos, que permite diferenciar regiões metiladas de não metiladas em DNA tratado com bissulfito.31,32 Esse método baseia-se na amplificação com primers não sensíveis à metilação (que devem conter sítios CpG em sua sequência) e utiliza marcadores fluorescentes intercalados à dupla fita de DNA, de maneira que, à medida que a temperatura aumenta, as fitas duplas se separam, e a fluorescência é emitida proporcionalmente ao conteúdo de citosinas ou timinas nos produtos da PCR. Essa quantificação é possível porque, quanto maior o conteúdo de CG na sequência amplificada, maior a dificuldade de dissociação.5,33 O grau de metilação de produtos desconhecidos da amplificação pode ser determinado pela derivação de curvas de dissociação e comparação dos picos da curva (ou área abaixo da curva) da amostra com as de diluições conhecidas que variam de totalmente não metiladas (0%) a totalmente metiladas (100%) (Figura 8.3).5,32,34 Essas análises já eram possíveis por meio do método methylation-sensitive melting curve assay (MS-MCA), mas se tornaram mais

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bissulfito continua sendo o método de escolha se a resolução que se busca é de alto detalhamento) e o fato de que a purificação depende da concentração de CpG no local (resultados baixos podem indicar hipometilação ou regiões do genoma pobres em CpG, diminuindo sua especificidade). Todavia, esse efeito pode ser corrigido por técnicas de bioinformática, melhorando sua acurácia.49

Métodos de análises de genoma completo (genome-wide) Sabe-se que a maquinaria genômica é complexamente regulada por fatores de transcrição e epigenéticos, que respondem a alterações ambientais. Uma etapa fundamental ao entendimento dos mecanismos epigenéticos era confrontar a distribuição desses marcadores, em nível genômico, em células normais e doentes, ou expostas ou não a um fator ambiental (a exemplo da dieta).50 Na busca da compreensão de como esses mecanismos funcionam e se autorregulam, surgiu a necessidade do conhecimento de alterações em nível de genoma completo, e não mais locus-específico, e, consequentemente, de métodos que permitissem a busca dessas informações de maneira rápida, detalhada e global, sendo referidos como estudos de genômica ampla (do inglês, genome-wide studies). Em âmbito de descrição da sequência genômica, esses estudos ficaram conhecidos como genome-wide association studies (GWAS), sendo adaptados aos estudos epigenéticos como epigenome-wide association studies (EWAS). A princípio, foram utilizados métodos cromatográficos. Naqueles com base em cromatografia líquida de alta performance (HPLC, do inglês, high-performance liquid chromatography), o DNA genômico é hidrolisado quimicamente (com ácido fórmico em altas temperaturas, ou outras adaptações químicas e enzimáticas),51-53 e os desoxirribonucleosídeos são separados por HPLC (que permite a separação das quatro maiores bases – citosina, guanina, timina e adenina, bem como de menores modificações

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como a 5-metilcitosina) e quantificados em função da absorbância relativa de citosinas e metilcitosinas, em relação a um padrão de bases conhecidas.7,52 Uma quantidade relativamente grande de DNA (2,5Pg) é necessária para a detecção, e problemas inerentes à técnica de HPLC podem acontecer, como a precipitação de tampões dentro da coluna. Em termos de sensibilidade, esta pode ser aumentada pela utilização de espectrometria de massa associada.7 Outros métodos têm base em eletroforese capilar de alto desempenho (HPCE, do inglês, highperformance capillary electrophoretic) e conferem algumas vantagens na quantificação de DNA metilado, sendo mais rápidos que HPLC (menos de 10min por amostra) e mais baratos, por não requererem tampões de corrida e maior potencial de fracionamento. Normalmente, tal método envolve uma hidrólise enzimática, seguida pela separação em eletroforese capilar, e quantificação computadorizada em processador de dados. O grau de metilação da amostra é calculado por:54

área abaixo da curva de citosinas metiladas × 100 área abaixo da curva de citosinas + área abaixo da curva de citosinas metiladas Posteriormente, os métodos de análises de metilação de DNA em nível genômico passaram a consistir na combinação dos métodos já descritos para estudos locus-específicos (métodos com base no tratamento com bissulfito, na restrição enzimática ou na purificação por afinidade) a métodos de análise em larga escala, como microarranjos e sequenciamento de nova geração, gerando uma infinidade de métodos possíveis. Os microarranjos foram propostos, a princípio, como uma técnica de determinação de anticorpos,55 passando, posteriormente, a ser utilizados em estudos genômicos. Também chamados chips de DNA, os microarranjos são matrizes 2D em lâminas de vidro nas quais sondas de fita única de DNA (aproximadamente 50

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126 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis a 70pb) complementares a um determinado gene são fixadas ordenadamente em pontos específicos do chip (spots), para que se hibridizem ao material a ser analisado. Dezenas ou até centenas de milhares de spots podem estar presentes na matriz, permitindo a avaliação de um grande volume de dados simultâneos e a cobertura do genoma total. Esse método é normalmente utilizado na determinação de perfis de expressão gênica, nos quais se deseja comparar grupos tratados em relação a controle, doentes versus sadios, pré e pós-intervenção, entre outros, podendo também ser utilizados em estudos epigenéticos. De maneira geral, os DNA das duas situações são corados com fluoróforos distintos (geralmente verde e vermelho), os quais emitirão sinal de fluorescência, caso se hibridizem às sondas da matriz, pelo princípio da complementaridade de bases. A lâmina hibridizada é então submetida a um scanner, conectado a software específico, o qual quantificará a intensidade da fluorescência proporcionalmente à abundância do gene expresso, determinando sua hipo ou hiperexpressão em determinada condição.56 Em casos em que os genes são expressos em somente um dos grupos, a fluorescência verde ou vermelha será emitida. Se esses genes forem expressos em ambos os grupos, a fluorescência será amarela. No caso de estudos de metilação de DNA, essas sondas são específicas para amplificação de regiões metiladas e não metiladas, podendo ser interpretadas da mesma maneira que para a expressão gênica (hipo ou hipermetiladas, em função da intensidade do sinal de fluorescência). Os métodos de determinação de metilação de DNA com base em microarranjos podem ser combinados aos tratamentos prévios por bissulfito, restrição enzimática e purificação por afinidade, conforme já descrito. No caso de métodos com base na conversão por bissulfito, o DNA previamente modificado é hibridizado com sondas que reconhecem CpG específicos,

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metilados ou não, a partir de citosinas ou timinas. O Illumina Methylation Assay (Infinium ) é um dos métodos que se baseiam nesse princípio, apresentando as vantagens inerentes ao tratamento por bissulfito, de detecção de um único CpG, associado a alta detecção e larga escala do microarranjo. Obtém-se assim uma cobertura de aproximadamente 96% das ilhas CpG.6,57 Neste método, o grau de metilação de uma citosina é determinado pelo valor beta, que corresponde à razão do sinal metilado pela soma dos sinais (metilado + não metilado).58 No que se refere aos métodos com base em restrição enzimática, o methylated CpG island amplification with microarray hybridization (MCAM) se baseia na ação diferencial das endonucleases SmaI e XmaI em clivar regiões metiladas ou não, purificando regiões metiladas, combinada à detecção por hibridização a microarranjos.59 Tal técnica reduz a complexidade e aumenta a especificidade aos CpG metilados, restringindo, no entanto, a abrangência da representação.60 Outro método, conhecido como hpaII tiny fragment enrichment by ligation mediated PCR (HELP) foi desenvolvido combinando a especificidade das endonucleases HpaII e MspI (controle) na restrição do DNA com a detecção por microarranjos, possibilitando uma análise quantitativa, de alta resolução.61 Finalmente, os métodos com base em purificação por afinidade utilizam o princípio da imunoprecipitação com anticorpo específico para regiões metiladas (MeDIP), associado à múltipla hibridização por microarranjos, sendo o método mais conhecido referido como MeDIP-chip.62 De maneira geral, métodos de microarranjo apresentam capacidade analítica de larga escala, porém baixa especificidade, necessitando ser validados por outras técnicas, tais como MethyLight, COBRA, pirossequenciamento, entre outros.63 Ademais, uma grande desvantagem dos microarranjos é que eles demandam o conhecimento prévio da sequência de DNA, bem como a possibilidade de hibridização cruzada

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entre sequências, restringindo sua utilização em fragmentos repetitivos ou desconhecidos do genoma.64 Nesse contexto, o sequenciamento de nova geração surgiu como alternativa aos microarranjos, diminuindo os vieses daquele e acelerando os estudos de epigenética. No entanto, os métodos com base em microarranjos não perderam seu espaço, continuando a ser utilizados, principalmente em estudos de modificações de padrões em relação a uma doença, intervenção ou exposição, em função da familiaridade da comunidade científica com o método e as ferramentas de bioinformática utilizadas nas análises.64 O primeiro método de sequenciamento foi desenvolvido pelo bioquímico inglês Frederick Sanger, em 1977. De maneira simplificada,

o DNA é separado em fitas simples, às quais, após a ligação do primer, a DNA-polimerase inicia a incorporação de nucleotídeos à sequência. Junto ao pool de nucleotídeos são acrescentados desoxinucleotídeos que interrompem a extensão, gerando fragmentos de diversos tamanhos, terminados sempre em uma base conhecida. Assim, os fragmentos são separados e sequenciados por eletroforese capilar, de acordo com seu tamanho (Figura 8.5).65 Embora, a princípio, o sequenciamento de Sanger tenha sido utilizado em estudos epigenéticos,12 a grande demanda por técnicas rápidas e menos laboriosas fez com que se tornasse obsoleto a esses propósitos e que sequenciamentos de nova geração surgissem, a partir de 2005, como novos métodos de escolha. Esses novos sequenciamentos apresentavam como grande

Replicação do DNA Primer 5'...

...3' DNA-polimerase Pool de nucleotídeos

dATP

5'...

...3'

5'...

...3'

dTTP

dGTP

dCTP

G T A A C T A G G G T C

dATP dTTP dGTP dCTP Eletroforese capilar

Desenho esquemático do sequenciamento de Sanger: o DNA é separado em fitas simples, às quais Figura 8.5 serão incorporados nucleotídeos (pool) à sequência, por ação da DNA-polimerase. Junto ao pool de nucleotídeos são acrescentados desoxinucleotídeos conhecidos que interrompem a extensão, gerando fragmentos de diversos tamanhos, terminados sempre em uma base conhecida. Os fragmentos finalizados em cada desoxinucleotídeo (dATP, dTTP, dGTP e dCTP) são separados por eletroforese conforme seus tamanhos, gerando a sequência de interesse

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128 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis inovação a amplificação clonal e, portanto, permitiam que um número muito maior de amostras fosse analisado, em alta resolução, e a um custo relativamente muito menor. As técnicas de sequenciamento de nova geração podem ser didaticamente subdivididas em etapas de: ■ Preparação da biblioteca genômica. ■ Escolha da plataforma de sequenciamento. ■ Análise dos dados. Na etapa de preparação da biblioteca, o DNA genômico é fragmentado, e cada fragmento é adicionado a dois distintos adaptadores (um em cada extremidade) que, posteriormente, serão reconhecidos e hibridizados a sequências complementares fixadas à matriz utilizada para amplificação clonal.50 No que se refere à plataforma de sequenciamento, as mais utilizadas em estudos epigenéticos são as chamadas plataformas de sequenciamento de segunda geração (Illumina Genome Analyzer, Supported Oligo Ligation Detection – SOLiD da Life Technologies, e 454 da Roche), embora já estejam disponíveis plataformas de terceira geração (Helicos; Pacific Biosciences e Oxford Nanopore Technology).66,67 A plataforma Illumina é a mais utilizada e consiste em um sequenciamento por síntese reversa, em que a enzima DNA-polimerase utiliza nucleotídeos marcados com diferentes fluoróforos para a extensão, os quais são detectados à medida que se incorporam à sequência de base. O DNA fragmentado e ligado aos adaptadores se hibridiza a uma superfície de clonagem (flowcell – uma espécie de chip especializado em que oligonucleotídeos complementares aos dois adaptadores são ancorados à superfície, de maneira que um dos adaptadores se hibridiza), permitindo a amplificação do fragmento. Após a amplificação, a dupla fita de DNA é desnaturada e a cópia original é descartada. A sequência complementar forma então uma ponte de amplificação, em que o

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adaptador da outra extremidade se liga a seu oligonucleotídeo complementar na matriz, possibilitando novos ciclos de amplificação, e a formação de milhares de cópias de fragmentos complementares (clusters) a uma única sequência. Para o sequenciamento desses fragmentos, primers se ligam aos adaptadores e a DNA-polimerase incorpora os nucleotídeos marcados. Esses clusters permitem maior sinal de fluorescência, com intensidade detectável. Os fluoróforos são detectados e analisados por programas computacionais, por meio de alinhamentos – sobreposição, comparação e ordenação (Figura 8.6) – de sequências, gerando a sequência original, e permitindo um sequenciamento massivo paralelo.68 Uma segunda leitura é realizada a partir do adaptador da outra extremidade, a fim de evitar alinhamentos ambíguos, uma vez que as sequências geradas (readers) são curtas (máximo 100pb em um sequenciamento tradicional).50 A plataforma Illumina pode gerar leituras de 3 a 7,5Gbases por corrida. A plataforma SOLiD, por sua vez, consiste no sequenciamento por ligação. Assim como na plataforma Illumina, o DNA é fragmentado (60 a 90pb) e ligado a dois adaptadores universais; no entanto, a reação de sequenciamento é determinada por uma DNA-ligase, ao contrário da polimerase, e a amplificação clonal ocorre em uma microesfera de agarose, que contém

CTAGATTCC CCTCAGCTAGA GATTCCAGCCAA AGCTAGATT

CCTCAGCTAGATTCCAGCCAA Alinhamento de sequências: determiFigura 8.6 nação da sequência original com base em sobreposição, comparação e ordenação de fragmentos

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Ácidos Graxos e Expressão de Genes Promotores de Marcadores Inflamatórios Roberta de Oliveira Bernardes • André Gustavo Vasconcelos Costa • Dennys Esper Cintra

INTRODUÇÃO Classicamente, a descrição comum sobre o processo inflamatório ocorre sob o ponto de vista de uma resposta do tecido à agressão celular. Essa resposta pode se caracterizar como fenômeno complexo, dinâmico e multimediado, manifestando-se a partir de qualquer agente lesivo, como físico (queimadura, radiação, trauma), biológico (microrganismo, reações imunológicas) ou químico (substância cáustica). O processo inflamatório envolve complexa cascata de eventos bioquímicos, celulares e moleculares, que incluem: extravasamento de fluidos, ativação enzimática, migração celular, liberação de mediadores, sensibilização e ativação de receptores, lise tecidual e de reparo. Além disso, esses eventos são responsáveis pela manifestação dos sinais clínicos clássicos da inflamação, norteados por sensações de dor, calor, tumor e rubor, descritos pelo médico romano Aulus Cornelius Celsus. Posteriormente, o médico Claudius Galenus (Galeno de Pérgamo) acrescentou um quinto sinal, functio laesa ou a perda de função do local afetado.1 A este processo de caráter agudo se dá o nome de “inflamação de alto grau”. Contudo, não seria estranho imaginar a existência de um processo inflamatório subclínico.

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Tal processo foi caracterizado por volta do ano 2000, em que moléculas inflamatórias foram encontradas no organismo humano, sem a manifestação dos clássicos sinais clínicos. Somente mais tarde compreendeu-se que parecia haver um determinado “grau” ou “concentração” específica para suas ações inflamatórias. Posteriormente, foi evidenciado que, mesmo em concentrações incapazes de manifestarem os sinais clínicos do processo inflamatório, essas moléculas poderiam causar danos, em geral, em um estado crônico. Essa inflamação crônica é associada a diversas doenças, também de caráter crônico, com destaque para obesidade, resistência à insulina e diabetes e doenças cardiovasculares, que, em conjunto, originam o chamado risco cardiometabólico. Deve-se destacar que ambos os tipos de intensidade inflamatória são iniciados de forma semelhante e têm o mesmo objetivo: restaurar a função tecidual que se encontra corrompida. Contudo, o processo inflamatório subclínico é induzível pelo perfil dietético, especialmente pelos diversos tipos lipídicos consumidos, e também pelo acúmulo de peso na forma de massa corporal gorda. O tipo e a quantidade de lipídios consumidos podem afetar o sistema imune e também interferir na síntese de diversas substâncias. Quando

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284 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis os ácidos graxos são liberados pela membrana plasmática ou incorporados por via extracelular, podem sofrer degradação ou influenciar vias de produção dos eicosanoides e marcadores inflamatórios. Os ácidos graxos da dieta são os fatores mais fortemente correlacionados com a inflamação subclínica, fazendo com que os ácidos graxos séricos em humanos se tornem biomarcadores de doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), como a obesidade.2-4 O extenso número de evidências demonstra que os ácidos graxos têm efeito na modulação de genes responsáveis por promover tanto a resposta pró- quanto a anti-inflamatória.5-7 Os ácidos graxos saturados têm sido relacionados com o aumento de substâncias inflamatórias, ao passo que os ácidos graxos monoinsaturados e poli-insaturados têm sido envolvidos em estímulos à produção de compostos anti-inflamatórios. Assim, avaliar o perfil lipídico consumido e, consequentemente, seu impacto na regulação do processo inflamatório é uma abordagem a ser incentivada no contexto do tratamento de DCNT.

INFLAMAÇÃO SUBCLÍNICA E BIOMARCADORES A inflamação é considerada uma resposta de defesa do organismo a alguma lesão ou infecção, causada por ferimento ou invasão de microrganismos, geralmente localizada, transitória e autolimitada.8 O processo inflamatório tem como objetivo solucionar o dano tecidual e envolve a participação de células circulantes, ativação enzimática, sensibilização e ativação de receptores para a ação contra agentes estranhos no local infectado. Quando os estímulos desencadeantes da resposta inflamatória são autocontrolados ou tratados, a inflamação cessa. Entretanto, quando a resposta não é controlada ou tratada, ocorre exacerbação do processo, levando à cronicidade do problema.9 A inflamação crônica é associada a diversas

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doenças, também de caráter crônico, mas não transmissíveis, com destaque para obesidade, resistência à insulina e diabetes e doenças cardiovasculares – dislipidemias, hipertensão e aterosclerose –, que, em conjunto, originam o chamado risco cardiometabólico.10,11 O lipopolissacarídeo (LPS) é componente da parede celular de bactérias gram-negativas, responsável pelo início do estímulo inflamatório. A resposta se inicia quando a fração lipídica do LPS se liga à proteína de ligação de lipopolissacarídeo (LBP) e é transportada até se ligar ao receptor da superfície de células circulantes, que podem ser macrófagos ou monócitos, por exemplo.12 As células do sistema imune conseguem detectar essa ligação e a interpretam como um agente invasor, disparando a resposta inflamatória, intensificando-a e estimulando o recrutamento de mais células do sistema imune. Para isso, ocorre aumento na produção de citocinas, com destaque para o fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) e interleucinas (IL), além de quimiocinas.1 O processo inflamatório conta com a ação de mediadores como histamina, eicosanoides, bradicinina, prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos e fator ativador de plaquetas (PAF), que estão relacionados com as respostas de vasodilatação, calor e edema, o último gerado por extravasamento de líquido no local; e que prolongam a resposta inflamatória.13 Muitos mediadores lipídicos, como alguns dos citados anteriormente, são derivados de ácidos graxos. Inicialmente, a fosfolipase, devido à sua atividade catalítica, hidrolisa fosfolípidios de membrana com liberação de ácidos graxos livres e de alguns ácidos graxos poli-insaturados (AGPI).14 O ácido araquidônico é o ácido graxo mais predominantemente liberado e serve de substrato para as enzimas cicloxigenases (COX) e lipoxigenases (LOX).15 Conforme citado anteriormente, algumas DCNT também são capazes de gerar quadro inflamatório, eliminando a ideia de que a

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inflamação seja induzida apenas por um microrganismo ou decorrente de traumatismo. Nessas situações, é observado aumento ainda mais acentuado nas concentrações de citocinas próinflamatórias, TNF-alfa e IL-1beta, e de proteínas, proteína C-reativa (PC-R) e proteína sérica amiloide A. Juntos, TNF-alfa e IL-1beta compartilham ações celulares, estimulando IL-6, macrófagos e COX-2 para secreção de mais prostaglandinas.10 Embora se saiba que alguns microrganismos sejam capazes de gerar doenças infecciosas e iniciar quadros inflamatórios, o questionamento que se faz é: como os microrganismos são detectados pelo organismo? Em sistemas biológicos, a detecção ou o reconhecimento de microrganismos invasores geralmente é dependente de receptores. Por exemplo, receptores de reconhecimento de padrões (PRR) fazem o reconhecimento de estruturas presentes em microrganismos, denominados padrões microbianos associados a patógenos (PAMP). O padrão microbiano do LPS, por exemplo, é comum em todas as bactérias gram-negativas.16,17 Quando um PAMP é reconhecido por um PRR, a cascata de sinalização intracelular é ativada, culminando na estimulação de genes de transcrição para a produção de componentes antivirais, mediadores pró-inflamatórios e espécies reativas de oxigênio.18 Existem diferentes classes de PRR, dentre elas, a do receptor tipo Toll (TLR; do inglês, tolllike receptor). A família do TLR tem como função principal o controle das respostas inflamatórias e imunes e, em mamíferos, é composta por receptores homólogos de 1 (TLR1) a 13 (TLR13), mas os TLR11/12/13 só foram identificados em roedores. A expressão do TLR pode ser estimulada por diferentes tipos celulares e isso faz com que sua localização também seja diversificada. Os TLR1/5/6/10 são expressos na membrana plasmática, ao passo que os TLR3/7/8/9 são expressos nos endossomos e os TLR2/4 são expressos em ambos os locais.19,20

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O TLR4 foi o primeiro membro de sua família a ser descoberto. Alguns ligantes, com destaque para o LPS e alguns ácidos graxos saturados (AGS), conseguem ativar o TLR4 e fazer a sinalização. Sua sensibilização pelo LPS ativa a síntese de citocinas pró-inflamatórias. Quanto aos AGS, estudos indicam que podem contribuir com a inflamação, ativando o fator nuclear kappa B (NF-NB; do inglês, nuclear factor kappa B) e estimulando a liberação de COX-2 em macrófagos, ao se ligar com o TLR4. Isso indica que o tipo de gordura presente na dieta pode desempenhar papel importante no processo inflamatório.21,22 Na Figura 16.1, é possível ver os ácidos graxos atuando como ligantes do TLR4, ativando ou inibindo a expressão de marcadores inflamatórios.

ÁCIDOS GRAXOS E INFLAMAÇÃO NAS DOENÇAS CRÔNICAS NÃO TRANSMISSÍVEIS O consumo de lipídios é de extrema importância para a saúde, inclusive de gorduras saturadas. Além de fornecerem aporte calórico, fazem parte da composição de membranas celulares e estão envolvidos em diversas reações químicas. Entretanto, o tipo e a quantidade de lipídios na dieta ditarão seu próprio efeito no organismo. Os lipídios ingeridos podem afetar o sistema imune e também podem interferir na síntese de diversas substâncias. Quando os ácidos graxos são liberados pela membrana plasmática ou incorporados por via extracelular, podem sofrer degradação ou influenciar vias de produção dos eicosanoides e marcadores inflamatórios. Isso faz com que algumas funções passem a ser moduladas pela ação de ácidos graxos.2 A Tabela 16.1 apresenta alguns efeitos que os ácidos graxos exercem em DCNT.

Ácidos graxos saturados A ingestão de dieta com alto teor de AGS tem sido associada ao desenvolvimento de diversas

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LPS

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TLR4

AGMI AGPI

(w-3)

IL-1b, IL-6, TNF-alfa iNOS, COX-2, MCP-1 (expressão gênica)

Núcleo

Figura 16.1

Regulação da expressão de marcadores inflamatórios por ácidos graxos mediada pelo TLR-4

LPS: lipopolissacarídeo; TLR-4: receptor tipo Toll 4; AGMI: ácido graxo monoinsaturado; AGPI: ácido graxo poli-insaturado; AGS: ácido graxo saturado; COX-2: cicloxigenase 2; iNOS: óxido nítrico sintase induzível; IL: interleucinas; IL-1beta: interleucina 1beta; IL-6: interleucina 6; MCP-1: proteína quimioatrativa de monócitos 1; TNF-alfa: fator de necrose tumoral alfa. Fonte: adaptada de Abdul-Cader et al., 2016.16

doenças, dentre elas a obesidade e, portanto, toda a miríade de doenças acopladas à obesidade, que não apenas as doenças arteriais coronarianas, resistência à insulina e diabetes, mas também diversos tipos de câncer, osteoporose, artrite, asma, doenças neurodegenerativas e precipitação de várias doenças que cruzam com a base inflamatória induzida pela obesidade.

Ácidos graxos saturados e obesidade A obesidade é uma das doenças de maior prevalência no mundo, sendo considerada fora de controle. A obesidade é doença multifatorial,

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com base em aspectos genéticos, psicológicos e sociais. Não apenas o consumo alimentar desordenado contribui para o avanço da doença, mas também a inatividade física. No que tange ao consumo alimentar, a ingestão excessiva de gordura predominantemente saturada é um dos principais fatores.34 O principal órgão controlador de consumo alimentar e gasto energético, o hipotálamo, pode ser profundamente influenciado pelo estado alimentar do indivíduo, bem como pela qualidade desse estado alimentar. Alterações no funcionamento hipotalâmico representam um contribuinte fundamental e marcante ao desenvolvimento da

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Tabela 16.1

Efeito dos ácidos graxos em doenças crônicas não transmissíveis

Tipo de ácido graxo

Efeitos

Referências

Aumento

Redução

Ácido graxo saturado

■ Em cultivos celulares: IP-10 e NF-NB ■ Em animais: citocinas inflamatórias, apoptose neuronal ■ Em humanos: IL-6, PC-R, IL-10

■ Em animais: leptina e insulina ■ Em humanos: adiponectina

Fioroni et al., 2012;4 Milanski et al., 2009;23 Pistell et al., 2010;24 Aqil et al., 2012;25 Kennedy et al., 200926

Ácido graxo monoinsaturado

■ Em humanos: sensibilidade à insulina

■ Em humanos: expressão de genes inflamatórios, colesterol, IL-1beta, triacilgliceróis, e-selectina

Niknam et al., 2014;27 Ni et al., 2015;28 Bhatt & Misra, 201429

Ácido graxo poliinsaturado

■ Em cultivos celulares: PC-R (associada ao consumo de ômega-6) ■ Em animais: marcadores inflamatórios (associados ao consumo de ômega-6)

■ Em cultivos celulares: PC-R (associada ao consumo de ômega-3), colesterol total, LDL, glicose e NF-NB ■ Em humanos: IL-1beta e PC-R (associadas ao consumo de ômega-3)

Choque et al., 2015;30 Teng et al., 2014;31 Martínez-Micaelo et al., 2016;32 Chen et al., 201533

IP-10: proteína induzida por interferona 10; NF-NB: fator nuclear kappa B; IL: interleucina; PC-R: proteína C-reativa; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HDL: lipoproteína de alta densidade; TNF-alfa: fator de necrose tumoral alfa; ômega-3: ácido graxo ômega-3; ômega-6: ácido graxo ômega-6.

obesidade. Diversos estudos indicam que tanto na obesidade induzida por consumo excessivo de alimentos ricos em gordura quanto na obesidade ocasionada por fatores genéticos, a inflamação hipotalâmica é um achado comum, e que leva ao descontrole sobre a ingestão alimentar e sobre o balanço energético. Estes são os dois fatores mais importantes para a manutenção da estabilidade da massa corporal.23,35-37 Após o consumo de dietas ricas em gorduras saturadas, os AGS atingem a circulação e diversos tipos celulares são expostos a tais gorduras, incluindo adipócitos, macrófagos e células endoteliais. Consagrado na literatura até mesmo como agente padrão de indução inflamatória em diversos experimentos, o ácido graxo saturado palmítico (C16:0) pode levar ao aumento da sinalização inflamatória induzida por meio do receptor TLR4. Consequentemente e já no âmbito intracelular, proteínas como o IKKE e o complexo NF-NB regulam a imunidade inata, transduzindo o sinal do TLR4 até o núcleo e transcrevendo os genes controladores de diversas proteínas inflamatórias. Proteínas como o IKK e também como as citocinas

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e interleucinas TNF-alfa, IL-1b, IL-6 apresentam a chamada “atividade de serinas quinases”, ou seja, se comportam como enzimas doadoras de fósforo (quinases) para proteínas com resíduos expostos na região dos aminoácidos serina. O LPS também é um potente indutor de INNβ e NF-NB, na maioria das células. A maior parte da atividade do LPS está contida em uma fração lipídica (lipídio A) que é acilada com AGS. A remoção desses ácidos graxos ocasiona a perda de atividade da endotoxina. O TLR4 está envolvido, então, não apenas com a resposta inflamatória induzida por LPS, mas também por ligantes não bacterianos, como o ácido láurico (C12:0), outro tipo de ácido graxo saturado, abundantemente encontrado no óleo de coco.22,38 Estudos indicam que indivíduos obesos podem apresentar déficits de aprendizado, perda de memória e dificuldade de execução de funções, quando comparados com indivíduos eutróficos. Experimentos com animais corroboram esse indicativo de vulnerabilidade neurológica em obesos, relacionada com dietas ricas em gordura, por induzirem inflamação no sistema nervoso central.24,39,40

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288 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis Em estudo com cultivo de células, foram utilizados astrócitos derivados de ratos machos e fêmeas com 1 a 3 dias de idade. Primeiramente foram retiradas células da glia e, após 7 a 10 dias de tratamento in vitro, removeram-se entre 70% e 80% das células da cultura de astrócitos. As células restantes foram deixadas em recuperação durante 24 a 48h antes dos tratamentos. Um dos tratamentos do estudo consistia em um mix de AGS, composto por ácidos láurico (C12:0), palmítico (C16:0) e esteárico (C18:0). Os resultados indicaram que os AGS iniciaram a sinalização para expressão de citocinas inflamatórias pelos astrócitos, de forma dose-dependente, ou seja, quanto maior fosse a concentração de ácido graxo saturado na circulação, maior era a liberação de citocinas inflamatórias pelas células. Tal efeito pareceu requerer a ativação de TLR4 e demonstrou que os AGS desempenham efeitos neurológicos adversos, relacionados com a obesidade.25 Em outro estudo com cultivos celulares, utilizando-se monócitos de linhagem humana que sofreram diferenciação para macrófagos, foram preparadas soluções de ácidos graxos livres. As células receberam ácidos palmítico (C16:0) e láurico (C12:0) em concentrações de 150μM, durante 48h. Os demais grupos receberam ácidos graxos insaturados. O ácido palmítico é o ácido graxo livre mais predominantemente liberado pelo tecido adiposo, tendo sido possível observar a ativação de uma quimiocina denominada “proteína induzida por interferon gama 10” (IP-10), por meio da ativação de NF-NB. Tal resultado indica que, em indivíduos obesos, em que a concentração de ácido palmítico geralmente encontra-se elevada, ocorre ativação de NF-NB com expressão de IP-10 em macrófagos, contribuindo para o agravamento da inflamação.41 Por outro lado, em estudo com ratos alimentados com dietas ricas em AGS durante 8 semanas, foi demonstrada relação entre o consumo desses ácidos graxos e lesão no hipotálamo dos animais.

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Foi observado que os ácidos graxos saturados apresentam propriedade molecular eficiente para sinalizar uma resposta inflamatória por ativação do TLR4. Essa sinalização induz a expressão de citocinas inflamatórias e geram apoptose de neurônios, fazendo com que o hipotálamo perca sua função e se torne resistente aos hormônios anorexígenos, insulina e leptina, favorecendo o desenvolvimento da obesidade.23 No que se refere a humanos, sabe-se que indivíduos obesos apresentam aumento na secreção de proteínas pró-inflamatórias pelo tecido adiposo, como citocinas, proteínas de fase aguda e mediadores inflamatórios que contribuem para a instalação da inflamação de baixo grau (ver Capítulo 5, Inflamação e Estresse Oxidativo no Desenvolvimento das Doenças Crônicas Não Transmissíveis). Ácidos graxos da dieta são os fatores mais fortemente correlacionados com a inflamação subclínica, fazendo com que os ácidos graxos séricos em humanos se tornem biomarcadores de DCNT, como a obesidade.4,42 Em uma revisão de estudos clínicos em humanos sobre o efeito modulatório de ácidos graxos na expressão gênica, concluiu-se que o consumo de ácidos graxos saturados está relacionado com o aumento de genes relacionados ao processo inflamatório, tais como o marcador de macrófago CD16A, proteína quimioatrativa de monócitos 1 (MCP-1), metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9), interleucinas IL-1 e IL-6, TNF-alfa e fator de transcrição p65, tanto em células mononucleares do sangue periférico quanto no tecido adiposo,6 Além disso, um estudo relacionou obesidade, resistência à insulina e inflamação de baixo grau com os ácidos graxos da dieta, em que 123 indivíduos obesos apresentaram percentuais de AGS e AGPI (ômega-6) associados de forma significante às concentrações de IL-6. No entanto, não foi observada associação ao avaliar os mesmos parâmetros nos indivíduos eutróficos.43 De forma geral, estudos in vitro, com animais ou com humanos, conseguem retratar forte ligação entre os AGS da dieta, obesidade e

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recrutados 150 pacientes do sexo masculino que sofriam de doença arterial coronariana. Foi empregado questionário de frequência alimentar para posterior cálculo do consumo energético e quantificação de ácidos graxos da dieta. Em seguida, foram coletadas amostras de sangue dos voluntários e determinadas as concentrações de colesterol total, LDL, HDL e os marcadores IL-6 e PC-R. Observou-se que o alto consumo de AGS foi significativamente relacionado ao aumento da expressão dos marcadores inflamatórios IL-6 e PC-R.27 Em outro estudo, com o objetivo de observar os efeitos da alteração do tipo de ácido graxo da dieta sobre o funcionamento do tecido adiposo, foi conduzida a oferta de dietas ricas em AGS e ácidos graxos monoinsaturados (AGMI) a indivíduos com risco cardiometabólico. Os pesquisadores avaliaram o perfil de ácidos graxos, colesterol e citocinas do plasma dos participantes e determinaram a composição de ácidos graxos do tecido adiposo. Os resultados mostraram, mais uma vez, que o aumento do consumo de ácidos graxos na dieta foi responsável pelo aumento da expressão de genes envolvidos em processos inflamatórios também nesse tecido. Alguns desses processos inflamatórios, fortemente regulados pelos AGS da dieta, foram induzidos pelas sinalizações de linfócitos T e B e aumento da sinalização para leucócitos. Isso pode ser indicativo do aumento na atração de células imunes para o tecido adiposo, o que pode gerar infiltração no tecido, com recrutamento de macrófagos, intensificando e perpetuando a inflamação local.61

Ácidos graxos monoinsaturados Enquanto alguns AGS são retratados por seu perfil pró-inflamatório e atividades que levam a potenciais danos à saúde, os AGMI são associados com diminuição do risco de desenvolvimento de DCNT, melhora do perfil lipídico e diminuição de respostas inflamatórias.61

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Ácidos graxos monoinsaturados e obesidade A obesidade não é condição homogênea entre os indivíduos, uma vez que pessoas obesas podem ser saudáveis, não apresentando disfunções metabólicas (eumetabólicos), como também podem ter o risco aumentado para o desenvolvimento de diabetes, resistência à insulina e doenças arteriais coronarianas. Por esse motivo, muitos trabalhos desenvolvidos com indivíduos obesos abordam efeitos dos ácidos graxos em geral, relacionando-os com obesidade e comorbidades correlatas.28 Diversos dados revelam que o tecido adiposo hipertrofiado de indivíduos obesos apresenta alto grau de inflamação, o que pode contribuir para o desenvolvimento de resistência sistêmica à insulina. Como visto anteriormente, o tipo de gordura presente na dieta pode exercer forte efeito sobre a inflamação do tecido. Um estudo mostrou que indivíduos obesos submetidos durante 8 semanas a dietas ricas em AGS e AGMI tiveram a composição de ácidos graxos e concentrações de colesterol e citocinas determinadas no plasma. Enquanto os AGS exerceram influência sobre marcadores próinflamatórios, o consumo de monoinsaturados estimulou decréscimo na expressão dos mesmos marcadores, além do colesterol. Foi encontrada, ainda, alteração no perfil de ácidos graxos, com aumento em insaturados no plasma e tecido adiposo. Contudo, os autores não concluíram se os efeitos benéficos apresentados pelo consumo da dieta com alto conteúdo em AGMI foram decorrentes do aumento desses ácidos graxos na circulação, pela diminuição de saturados ou pela associação de ambos.61

Ácidos graxos monoinsaturados, resistência à insulina, diabetes e doenças cardiovasculares Os principais representantes dos AGMI são os ácidos graxos palmitoleico (C16:1) e oleico (C18:1). Entre estes, destaca-se o ácido oleico, que ganhou extrema evidência dentre os anos 1980 e 1990, com os grandes estudos

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292 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis populacionais que correlacionaram sua elevada presença na dieta mediterrânea com a reduzida incidência de doenças cardiovasculares. Ao longo da década de 2000, outros estudos surgiram mostrando seu potencial aliado à melhora em diversas características associadas ao risco cardiometabólico. Na sequência, com o advento da biologia molecular, outros estudos propuseram mecanismos interessantes que aqui seguem. Em 2005, alguns trabalhos apontavam para a capacidade do ácido oleico em bloquear o complexo NF-NB, caracterizando tal ácido como uma possível molécula anti-inflamatória. No entanto, apenas em 2010 um trabalho demonstrou o que seria o início do desvendamento molecular de suas ações. Morari et al. (2010)62 observaram que o ácido oleico, quando absorvido pelas células, era capaz de ativar uma proteína intracelular chamada de receptor ativado pelo proliferador de peroxissomos 1 alfa (PGC-1alfa). Quando essa molécula é ativada, imediatamente forma-se um dímero com outra proteína chamada c-MAF (sem designação específica). A proteína c-MAF é um fator de transcrição que, quando ativado pela PGC-1a, consegue migrar ao núcleo e transcrever o gene responsável pela proteína IL-10. A IL-10 é uma potente molécula anti-inflamatória, que atua desmontando a sinalização ativadora do NF-NB.62 Como demonstrado anteriormente, o sinal pró-inflamatório pode partir do receptor TLR4, mas também de receptores de citocinas, como TNF-alfaR, IL-6R e IL-1betaR. Quando esses receptores são ativados, propagam seus sinais ao interior da célula. Na base desses receptores, complexos grupamentos proteicos são formados a fim de continuarem transduzindo seus sinais. O TLR4, após intensas alterações conformacionais em sua base, propaga seu sinal até a proteína TAK-1 (fator de crescimento transformador beta ativado pela quinase 1). Apenas quando a TAK-1 é fosforilada, seu sinal segue em frente, ativando a próxima proteína, conhecida

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como IKK (inibidor da quinase kappa). Com a IKK fosforilada e ativada, a proteína sequencial que mantinha o NF-NB desligado, a INBD (inibidor kappa B alfa) é destruída. Concomitantemente, o NF-NB é liberado e migra ao núcleo para transcrever diversos genes de proteínas inflamatórias. Em paralelo a esses desdobramentos oriundos a partir do TLR4, os receptores de citocinas, quando ativados, também ativam vias semelhantes, culminando para uma via em comum à do TLR4, intensificando a ativação da proteína TAK-1. O receptor TNF-alfa recebe destaque devido ao fato de que, além desta atividade, ele também pode ativar uma via inflamatória independente do NF-NB, ativando a proteína anteriormente descrita, a JNK. Esta última também ativa seu fator de transcrição que fica localizado no núcleo da célula, intensificando a transcrição de genes pró-inflamatórios. Como mecanismo anti-inflamatório natural, a IL-10 atua como feedback negativo, desligando a fosforilação da proteína IKK.63 Logo, a sinalização inflamatória tenderia a regredir. Isso não ocorrerá enquanto ligantes dos receptores TLR4 e de citocinas estiverem ativos. No entanto, a IL-10 modula esse processo a fim de que a célula não exiba um processo inflamatório tão potente a ponto de destruí-la (apoptose). Posto tal mecanismo, fica clara a maneira utilizada pelo ácido oleico em reprimir parcialmente a inflamação. Interessantemente, o NF-NB é capaz de ativar diversos genes próinflamatórios e anti-inflamatórios. Como antiinflamatório, destaca-se a IL-10. Contudo, o ácido oleico consegue ativar exclusivamente o gene da IL-10, sem alterar os demais. Portanto, o ácido oleico surge como estratégia nutricional potente, na modulação de distúrbios que envolvam moléculas inflamatórias em concentrações elevadas. Com o ácido palmitoleico (C16:1, n-7), presente principalmente no óleo de macadâmia, essa estratégia ainda não foi testada. Assim

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como o ácido oleico, o palmitoleico não é uma gordura essencial ao organismo, ou seja, os mamíferos têm a capacidade de produzi-la. Em 2008, acabou ganhando destaque entre a comunidade científica por ter sido demonstrada como molécula sensibilizadora das ações da insulina. Curiosamente, ela é produzida em demasia no tecido adiposo visceral quando hipertrofiado. Nessa situação, o tecido adiposo exporta o ácido palmitoleico a outros tecidos como o fígado e o músculo, os quais respondem metabolicamente melhor após tal ativação. Após compreender que o tecido adiposo apresentava essa característica de exportação de palmitoleico, esse ácido graxo ganhou o status de lipocina.64 Nesse contexto, Cao et al. (2008)64 demonstram em seu experimento que, quando o tecido adiposo sofre hipertrofia, como no caso da obesidade, a liberação de ácido palmitoleico aumenta, e a substância atinge a corrente sanguínea, sensibilizando a via da insulina no fígado

e na musculatura esquelética. A infusão intraportal de ácido palmitoleico foi capaz de aumentar a fosforilação de proteínas da via da insulina como o receptor de insulina (IR), os substratos 1 e 2 do receptor de insulina (IRS1 e IRS2) e até mesmo a principal proteína envolvida na via, mas em uma posição bem distal ao receptor, a proteína quinase B (Akt) (Figura 16.2). Quando a Akt é fosforilada, diversas ações decorrentes da sinalização da insulina são efetivadas, como captação de glicose pelo tecido adiposo e o músculo, início da glicogênese e bloqueio da gliconeogênese, principalmente em músculo e fígado. A partir desse estudo, outros surgiram demonstrando o potencial desta substância nesse contexto. De forma interessante, o ácido palmitoleico parece exercer seus efeitos independentemente do processo inflamatório, ou seja, não é por meio da remissão inflamatória que ele exerce seus benefícios. Não obstante, ainda não há o mecanismo traçado.

AG-insaturados

120

GPR

GPR40

Figura 16.2 Receptores de ácidos graxos (AG) insaturados GPR. GPR120 reconhece primariamente graxos insaturados da família do ômega-3, na seguinte sequência de afinidade: docosaexaenoico (DHA), eicosapentaenoico (EPA), alfalinolênico (ALA), oleico e palmitoleico (A); GPR40 reconhece ácidos graxos insaturados, mas tem grande afinidade pelos ácidos oleico e palmitoleico. Reconhece também ácidos graxos ômega-3, mas com menor afinidade. É importante notar que esses receptores não reconhecem nenhum membro da família dos ácidos graxos ômega-6. Tais ácidos graxos ainda não contêm receptores descritos (B)

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294 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis Ambos os ácidos graxos palmitoleico e oleico tiveram, em 2010, seu receptor de membrana descrito. Receptores acoplados à proteína G (GPCR; do inglês G-protein-coupled receptor) são capazes de reconhecer diversas substâncias, entre elas os AGMI. O GPR40 é um receptor especializado no reconhecimento de ácidos oleico e palmitoleico, apesar de poder reconhecer, com menos afinidade, ácidos graxos da família dos ômega-3 (Figura 16.2).

Ácidos graxos poli-insaturados Os AGPI, também chamados de essenciais, são indispensáveis para a sobrevivência de seres humanos e outros mamíferos, pois não são sintetizados pelo organismo, sendo necessária sua ingestão pela alimentação.65 Os ácidos graxos ômega-3 (Z-3 ou n-3) e ômega-6 (Z-6 ou n-6) são famílias de ácidos graxos que contemplam três ou mais membros.

Os principais membros da família ômega-3 são: alfalinolênico (ALA; 18:3 ômega-3), eicosapentaenoico (EPA; 20:5 ômega-3) e docosaexaenoico (DHA; 22:6 ômega-3). Já os da família ômega-6 são os ácidos linoleico (LA) (18:2 ômega-6) e araquidônico (AA) (20:4 ômega-6).66 Os AGPI são incorporados pelos fosfolipídios de membrana e utilizados para a síntese de eicosanoides. Ácidos EPA e AA são convertidos pelas enzimas COX, LOX e fosfolipase A2 em prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos. Em geral, os eicosanoides derivados de AA são de natureza pró-inflamatória quando em excesso no organismo, enquanto EPA e DHA tendem a apresentar caráter anti-inflamatório, sendo precursores de autacoides e outros compostos bioativos envolvidos na resolução da inflamação e no recrutamento de leucócitos.67,68 Uma vez que ômega-3 e ômega-6 competem pelas enzimas COX e LOX (Figura 16.3) para

PLA2

EPA LOX

AA COX-1

EPA

COX-1

EPA COX-2

HETE

PGE2

PGE3

PGE2

PGE3

HPETE

PGI2

PGI3

PGI2

PGI3

LTA5

TXA2

TXA3

TXA2

TXA3

HETE

LTC4

LTB4

LTC5

LTD4

LTD5

LTE4

LTE5

LTB5

Figura 16.3 Vias metabólicas dos ácidos graxos poli-insaturados. Produção de eicosanoides. Eicosanoides derivados dos ácidos graxos ômega-6 e ômega-3 PLA2: fosfolipase A2; AA: ácido araquidônico; EPA: ácido eicosapentaenoico; LOX: lipoxigenase; COX-1 e 2: cicloxigenases 1 e 2; HETE: hidroxieicosatetraenoico; HPETE: hidroxiperoxieicosatetraenoico; LT: leucotrienos; PGE: prostaglandina; PGI: prostaciclina; TXA: tromboxanos.

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Microbiota nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis Lisiane Lopes da Conceição • Manoela Maciel dos Santos Dias • Mariana de Moura e Dias • Nathane Pais Siqueira • Sandra Aparecida dos Reis • Maria do Carmo Gouveia Peluzio

INTRODUÇÃO O termo microbioma engloba um conjunto complexo de microrganismos, seus genes e seus metabólitos. As regiões do corpo que abrigam essas populações incluem a pele, a cavidade oral e os tratos gastrintestinal, respiratório e urogenital.1 O microbioma intestinal engloba os microrganismos dos três grandes domínios da vida, Bacteria, Archaea e Eukarya, que interagem entre si e com o hospedeiro por meio das interações do tipo simbiose (mutuamente benéfico para ambas as partes); comensalismo (benefício de uma das partes sem necessariamente prejudicar a outra) e patogenicidade (obrigatoriamente envolve o prejuízo de uma das partes). Atualmente, o grande desafio da comunidade científica é elucidar como essas relações complexas e diversas podem afetar nosso estado de saúde.2 De modo geral, a microbiota intestinal pode atuar em imunomodulação, nutrição e metabolismo, proteção contra patógenos, regulação da adiposidade e também na estrutura e no funcionamento do trato gastrintestinal do hospedeiro. No entanto, esses efeitos benéficos na manutenção da saúde são observados em condições de equilíbrio entre os constituintes

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da microbiota (eubiose), enquanto alterações nessa composição (disbiose) têm sido observadas em condições patológicas e em doenças crônicas.3 Uma compreensão mais profunda e integrada das doenças que estão relacionadas com a desregulação da microbiota intestinal é de extrema importância, pois poderá auxiliar na elaboração de opções terapêuticas para o tratamento dessas doenças.4 Técnicas de sequenciamento a fim de gerar o perfil funcional e alcançar melhor resolução cultura-independente da composição das comunidades bacterianas, tais como metagenoma, metatranscriptoma e sequenciamento 16S, estão atualmente sendo empregadas. Na metagenômica shotgun, o pool completo de nucleotídeos que é isolado da amostra é sequenciado e permite a identificação das bactérias em espécies e inclusive em nível de cepa.5 Assim, pesquisas relacionadas à metagenoma intestinal utilizando RNA ribossomal 16S6 e sequenciamento shotgun do genoma completo7 têm sido realizadas a fim de se identificarem marcadores metagenômicos associados a muitas doenças crônicas. Essas técnicas têm proporcionado uma figura geral das comunidades microbianas comensais, assim como seu repertório funcional.

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358 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis Nesse contexto, o presente capítulo aborda, inicialmente, alguns conceitos inerentes à microbiota humana, e, em um segundo momento, descreve as principais evidências da participação dessa microbiota no desenvolvimento das principais doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), tais como obesidade, diabetes e doença cardiovascular, bem como na prevenção e/ou no tratamento das mesmas.

DESENVOLVIMENTO DA MICROBIOTA A sucessão microbiana intestinal é um processo temporal que pode ser dividido em quatro etapas: nascimento, pós-parto, até os 6 meses de idade e a partir dos 6 meses de idade (Figura 21.1). A primeira etapa, na maioria das vezes, é iniciada pelo parto normal. As bactérias residentes no canal vaginal e na região perineal ganham acesso ao trato gastrintestinal (TGI) previamente estéril do recém-nascido; nesse momento, são adquiridos os colonizadores primários. No caso do parto cesariano, os colonizadores primários advêm da microbiota do

Figura 21.1

ambiente e da equipe médica, e assim sugerese que a colonização do TGI seja atrasada nessa condição. A segunda etapa engloba os primeiros dias pós-parto, em que os recémnascidos entram em contato com outros microrganismos, os quais geralmente advêm dos cuidadores e do ambiente atual em que vivem. Nesse momento, adquirem-se os colonizadores secundários. Já a terceira etapa se estende até os 6 meses de idade da criança, em que o desenvolvimento da microbiota intestinal sofre interferência do tipo de alimentação láctea oferecida (aleitamento materno versus fórmula infantil). Na quarta e última etapa, a qual ocorre a partir dos 6 meses de idade, a microbiota se torna mais diversa e complexa, devido à maior exposição a outros substratos, uma vez que tem início a alimentação complementar associada ao desmame, o que estimula o crescimento de uma gama de microrganismos diferentes. A microbiota intestinal das crianças demanda um tempo de até 24 meses para desenvolver a estabilidade e a riqueza vista em adultos.8 É importante ressaltar que a composição da microbiota é específica de cada indivíduo, que é dominada

Após 6 meses

+ Microbiota mais diversa e complexa. + Aos 2 anos de idade, a microbiota intestinal da criança já apresenta a riqueza e a estabilidade observada em adultos.

Até 6 meses

+ Alimentadas com leite humano: Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides. + Alimentadas com fórmulas: Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Streptococcus.

Pós-parto

+ Bacteroides. + Clostridium. + Bifidobacterium.

Nascimento

+ Escherichia coli. + Enterococcus.

Representação esquemática da sucessão da microbiota intestinal

Fonte: adaptada de Teixeira & Machado, 2015.2

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por filotipos ainda não totalmente caracterizados.2 Somado a isso, vários são os fatores que podem afetar a composição da microbiota, tais como: ■ Tipo de parto. ■ Fatores maternos pré e durante o parto. ■ Tipo de aleitamento. ■ Idade. ■ Dieta. ■ Região geográfica. ■ Uso de antibióticos, probióticos, prebióticos e simbióticos. ■ Tipo sanguíneo. Considerando o papel essencial que a microbiota intestinal exerce sobre o estado de saúde humano, o desenvolvimento de algumas DCNT tem sido associado com alterações na composição dessa microbiota, conforme discutido nas próximas seções deste capítulo.

MICROBIOTA E OBESIDADE Com crescente aumento em diversos países,9 a obesidade é caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura, que pode acarretar em algum malefício a saúde.10 Além disso, é tida como um processo inflamatório, em que o grande número de bactérias formadoras da microbiota intestinal, com milhões de genes, pode contribuir para esse quadro inflamatório. Estudos sugerem que a microbiota intestinal pode atuar como um possível agente no combate à obesidade, juntamente com outros fatores já conhecidos, como a restrição calórica alimentar, a prática de exercícios físicos e a modulação de fatores genéticos, epigenéticos e ambientais. O papel da microbiota intestinal como fator de risco adicional para a obesidade foi constatado inicialmente por meio de estudos com animais germ-free. Observa-se que, após a introdução de bactérias nesses animais, houve aumento de marcadores inflamatórios, alterações no metabolismo da glicose11 e alterações em grupos específicos da microbiota

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intestinal, e o conjunto dessas alterações resultou em obesidade (Figura 21.2).12 Contudo, outros estudos com animais germ-free observaram que, por razões ainda não conhecidas, a microbiota intestinal impede esse processo, não permitindo a formação do tecido adiposo marrom e maior termogênese, o que, consequentemente, evolui para obesidade.12 Em indivíduos eutróficos observa-se também que eosinófilos e macrófagos infiltrados secretam interleucina (IL)-4, IL-13 e neuromoduladores como tirosina, hidroxilase e catecolaminas. Isso leva à diferenciação do tecido adiposo branco em tecido adiposo marrom, sendo o segundo mais termogênico.13 A microbiota intestinal de animais obesos é caracterizada pelo aumento de Firmicutes e diminuição de Bacteroidetes,12 sendo esse resultado semelhante ao observado em estudo com humanos, em que os indivíduos obesos apresentam aumento de Actinobacteria e Firmicutes e diminuição dos Bacteroidetes.14 Destacase que os Bacteroidetes são um grupo benéfico à saúde e, em indivíduos que perderam peso, observou-se aumento de Bacteroidetes e

Disbiose

Inflamação

Balanço energético Microbiota intestinal

Obesidade Sistema imune

Genética microbiana

Genética de hospedeiro

Figura 21.2 Fatores relacionados às alterações provocadas pela microbiota intestinal que contribuem no contexto da obesidade

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360 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis redução de Firmicutes.15 Além da composição, a diversidade e o número de bactérias também influenciam o desfecho da obesidade. Sabese que indivíduos obesos apresentam menor diversidade e menor número de Bacteroidetes, quando comparados aos indivíduos magros.15 Nesse contexto, a variedade da microbiota intestinal poderia ser um possível indicativo de saúde, no qual, quanto maior a diversidade microbiana, mais saudável o indivíduo.14 Do ponto de vista genético, observa-se que cada origem genética se relaciona a uma microbiota diferente e, por consequência, a maior ou menor propensão ao desenvolvimento do ganho de peso.16 Em estudo com gêmeos monozigóticos e dizigóticos, por exemplo, observou-se que os monozigóticos apresentaram microbiota intestinal mais próxima. Contudo, diferenças interpessoais foram observadas, o que ressalta a formação da microbiota intestinal não determinada apenas pela genética.14 Em seres humanos, as explicações sobre o papel da microbiota intestinal no ganho de peso corporal são mais complexas, visto que os processos de alimentação, de ganho de peso e de formação da microbiota intestinal envolvem múltiplos fatores. Hábitos alimentares, tempo de consumo de um alimento em detrimento de outro, sexo, idade, local de habitação, genética herdada dos pais, entre outros, são alguns dos múltiplos fatores que envolvem essa explicação.16

Controle da obesidade por meio da modulação da microbiota intestinal Como abordado previamente, observou-se que animais germ-free apresentaram menor ganho de peso que o grupo-controle após o consumo de dieta em mesma quantidade e composição, indicando que os animais germ-free estariam protegidos da obesidade causada pela dieta.12 Nesse contexto, a microbiota intestinal é considerada como um agente causador da obesidade, visto que as bactérias intestinais atuam influenciando desde a quantidade de energia

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que é absorvida da dieta até a expressão de genes envolvidos na síntese de novo e na oxidação lipídica.12 Em contrapartida, em caso de alterações genéticas que levam à obesidade, como a síndrome de Prader-Willi, observa-se que a microbiota intestinal também atua como um possível agente explicativo. Em estudo envolvendo crianças chinesas, observou-se disbiose na microbiota intestinal, mediante técnicas de metagenômica e de caracterização metabolômica dos metabólitos excretados. Contudo, essa disbiose também estava presente no grupocontrole (crianças obesas sem a síndrome), indicando que a alteração da microbiota intestinal é característica do quadro de obesidade.17 Nesse mesmo estudo, após a intervenção dietético-nutricional, com inserção de carboidratos não digeríveis, observou-se menor toxicidade da dieta, com consequente modificação nos grupos bacterianos. O resultado foi melhora do quadro de disbiose, sugerindo-se que a alimentação alterou a microbiota intestinal de modo a melhorar a saúde das crianças obesas, independentemente de terem ou não a síndrome.17 Desse modo, acredita-se que a modulação da microbiota intestinal tenha potencial para atuar como estratégia no desenvolvimento e na melhora das doenças metabólicas, ou seja, no tratamento.17 Além de atuar ora como causa, ora como cura da obesidade, a modulação da microbiota intestinal também pode atuar como agente de prevenção, haja vista que o consumo de alimentos probióticos e prebióticos pode estimular o crescimento de bactérias benéficas para a saúde do hospedeiro, principalmente as dos gêneros Bifidobacterium e Lactobacillus.18 Diante do exposto, a microbiota intestinal, no contexto da obesidade, apresenta múltiplos papéis, ao mesmo tempo que é modulada por fatores inerentes e modificáveis. Contudo, para melhor entendimento, são necessário mais estudos de metagenômica para identificação

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Bioestatística na Genômica Nutricional Fernando Luiz Pereira de Oliveira • Moysés Nascimento • Fabyano Fonseca e Silva • Adriano Marçal Pimenta

INTRODUÇÃO Na atualidade, os profissionais de saúde, de assistência direta (médico, enfermeiro, nutricionista, odontólogo, fisioterapeuta etc.) ou indireta (técnicos de laboratório, pesquisadores) têm se deparado com a necessidade de avaliação de características coletivas dos pacientes para o esclarecimento de hipóteses – sejam elas diagnósticas ou de pesquisa. Raramente se encontra bibliografia das ciências biológicas ou da saúde com descrições puramente qualitativas das características ou detalhes de um paciente individual ou do aspecto de células em um cultivo. Portanto, a informação científica se apresenta frequentemente como dados agregados, permitindo que qualquer observação seja quantificada, medida, estimada e comparada.1 Nas avaliações quantitativas, dois elementos são fundamentais: a magnitude de uma observação e sua variabilidade. Para estimar esses parâmetros, é necessário o uso da Estatística, por esta ser uma ferramenta que garante a capacidade de estabelecer conclusões sólidas.1 Conceitualmente, uma definição de Estatística pode ser vista como a arte e a técnica de recompilar, resumir, analisar e interpretar informações numéricas sujeitas ao azar ou às variações sistemáticas.2 Uma definição mais formal

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é que Estatística consiste em qualquer função que tenha a amostra como argumento e que tome valores no \n. A Estatística pode ser dividida em dois grandes campos: estatística matemática e estatística aplicada. A primeira está sob o domínio dos estatísticos, podendo ser de difícil compreensão para outros profissionais; requer profundos conhecimentos das ciências exatas e tem como objetivo criar novas teorias, métodos e procedimentos estatísticos. A estatística aplicada versa sobre o uso dos conhecimentos gerados pela estatística matemática para a resolução de problemas em diferentes campos do saber;1 quando este campo diz respeito às ciências biológicas ou às ciências da saúde, costuma-se utilizar o termo Bioestatística,2 a qual se divide em duas grandes áreas:3 ■ Bioestatística descritiva: sintetiza e resume as informações por meio de medidas de tendência central (médias, medianas, moda) e de dispersão (variância, desvio-padrão, intervalo interquartil), de frequências (absoluta, relativa) e representações gráficas. ■ Bioestatística analítica ou inferencial: estuda a relação entre variáveis distintas para estimar a associação entre elas e outras medidas de interesse.

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396 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis Os estudos nas áreas de genética clínica e de epidemiologia genética incorporam tanto a bioestatística descritiva quanto a bioestatística analítica ou inferencial para a análise dos seus resultados. A seguir, são mostradas algumas definições e técnicas estatísticas aplicadas a estudos em genética.

TECNOLOGIAS PARA ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA O conjunto de todos os transcritos em uma célula sob uma determinada condição fisiológica é denotado por transcriptoma. Assim, para o entendimento da dinâmica celular, é fundamental fazer inferências a respeito.4 Desde meados dos anos 1990, uma das principais técnicas utilizadas para estudos de transcriptomas consiste nos microarranjos de DNA (microarrays). Resumidamente, a técnica de microarray é constituída pela alocação de sequências de DNA complementar (cDNA) conhecidas (obtidas a partir de regiões cromossômicas de interesse) em posições especificas de uma lâmina de vidro ou em uma membrana de náilon. Essas sequências são hibridizadas contra cDNA marcados (sondas). No caso da utilização de membranas de náilon, os cDNA são marcados radioativamente; e quando se utilizam lâminas de vidro, estes são marcados por fluorescência (verde = Cyanine3 ou Cy3, e vermelha = Cyanine 5 ou Cy5). Após essa fase, a membrana ou lâmina é submetida a um processo de digitalização, de forma que os sinais provenientes da marcação sejam transformados em imagens que representam os níveis de expressão dos genes fixados no material utilizado. Essas imagens são então analisadas por softwares específicos que geram valores numéricos que representam a intensidade da expressão gênica. Apesar de terem sidos fundamentais para o estudo do transcriptoma, os microarrays apresentam algumas limitações, tais como: ■ Necessidade do conhecimento a priori das sequências a serem avaliadas.

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■ Grandes variações nos níveis de hibridização. ■ Precisão da medida de expressão. ■ Baixa reprodutibilidade de resultados entre laboratórios.

■ Diferentes plataformas. Recentemente, a tecnologia de sequenciamento em larga escala (RNA-seq) tem sido utilizada como uma alternativa aos microarrays. Esta se caracteriza por converter RNA em uma biblioteca de fragmentos de cDNA, de forma que cada molécula pode ser sequenciada por um sequenciador de nova geração que promove pequenas sequências (reads) com tamanho variando entre 21 e 500pb.4,5 Dessa forma, quanto maior a contagem de reads para um gene em uma certa condição experimental (tratamento), maior a sua expressão. O RNA-seq apresenta algumas vantagens em relação aos microarrays, dentre as quais se destacam: ■ A abundância é diretamente mensurada por meio da contagem das sequências produzidas (reads). ■ A detecção de transcritos não é restrita apenas aos preexistentes em uma sequência genômica (não é necessário conhecimento a priori sobre regiões de interesse). ■ A presença de maior flexibilidade de delineamentos experimentais, uma vez que o fator “lâmina”, inerente aos microarrays, não é considerado. Nesta parte do capítulo serão abordados alguns aspectos estatísticos e práticos quanto à análise de expressão gênica por meio de microarrays e RNA-seq. Além disso, algumas ferramentas computacionais para análise de expressão gênica no software livre R serão também apresentadas.

Conceito de “repetição” na análise de expressão gênica Um conceito de extrema importância em estudos de expressão gênica diz respeito à diferença

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entre repetição biológica e técnica. A falta de clareza desse conceito pode conduzir a situações nas quais seja impossível inferir de forma efetiva sobre a significância da expressão. O termo “repetição biológica” diz respeito a repetir os processos de hibridização (no caso de microarrays) ou sequenciamento (no caso de RNA-seq) de amostras de RNA originadas de fontes biológicas independentes sob os mesmos tratamentos. Essas réplicas objetivam a obtenção de informações sobre a variação biológica natural entre indivíduos. Já a repetição técnica se refere a repetir esses processos em amostras de RNA originadas de uma mesma amostra. Assim, essas repetições não são totalmente independentes uma da outra e são usadas para validar a acurácia das medidas do nível de expressão e modelar possíveis efeitos residuais provenientes de fontes não controladas no experimento. Como em todo estudo estatístico, o número de repetições necessárias para detectar diferenças entre tratamentos está diretamente ligado a vários conceitos, como, por exemplo, o conceito de poder do teste, o nível de significância adotada e até mesmo a diferença entre os tratamentos. Por meio de estudos de simulação de dados,6,7 tem sido relatado que, para se detectarem 80% dos genes diferencialmente expressos entre os tratamentos, recomenda-se, em média, o uso de pelo menos quatro repetições técnicas para cada repetição biológica.

Análise estatística de expressão gênica em experimentos de microarrays Em geral, o primeiro passo em estudos de expressão gênica por meio de microarrays é a conversão dos dados de intensidade luminosa para a escala logarítmica na base 2. Tal transformação tem por objetivo obter uma distribuição em que os valores de intensidade possam ser modelados via distribuição de probabilidade

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normal. Posteriormente, é necessário executar uma análise de qualidade dos dados, como, por exemplo, remoção de genes não expressos e arranjos com baixa intensidade. Após essa análise, os dados necessitam ser “normalizados” (termo diferente de normalização estatística quando o valor é subtraído da média da distribuição e dividido pelo desvio-padrão), visando remover efeitos globais de arranjos e corantes, os quais não refletem a variação genética verdadeira que se busca. Dentre os métodos de normalização, a regressão não paramétrica robusta (LOWESS, locally weighted scatterplot smoothing) usa suavizações locais para remover correlações gerais entre intensidade e proporção de intensidade. Entretanto, tal normalização global pode remover verdadeiras diferenças biológicas e, assim, modelos alternativos devem ser usados para remover os efeitos de lâminas e de corantes. Com o propósito de obter solução para esse problema,6 foi proposta uma modelagem em duas etapas: ■ Na primeira, os dados são modelados para os efeitos globais (todos os transcritos simultaneamente) de lâmina ou arranjo (A), corantes ou dye (D) e sua interação (AD) por meio do modelo Log2(y) = u + A + D + AD + resíduo. ■ Na segunda, os resíduos provenientes da primeira etapa são utilizados como variáveis dependentes em um novo modelo para os efeitos individuais (para transcritos) dado por: resíduo = u + A + D + AD + T + erro, em que T é o fator de tratamentos e erro é um vetor de erros específico para cada transcrito. Os efeitos A e AD devem ser ajustados como aleatórios, e os efeitos do fator D, como fixos. Os efeitos do fator T devem ser tomados como fixos quando se referirem à comparação de diferentes níveis de estresse aos quais determinado genótipo é submetido; e como aleatórios quando se referirem a mais de cinco genótipos tomados de uma população.

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398 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis Testes de significância para a expressão podem ser aplicados aos fatores de efeitos fixos (F e Wald) e aleatórios (razão de verossimilhanças ou análise de deviance). Uma alternativa à análise em duas etapas é a realização da normalização simultaneamente ao ajuste de todos os demais fatores do modelo, e também da avaliação de todos os efeitos de genes individuais, conforme proposto por via do seguinte modelo estatístico:8 yijkm = u + Ai + Dj + ADij + Gm + AGim +DGjm + Tk + TGkm + eijkm Em que yijkm é o valor de expressão na escala log2 e eijkm é um resíduo comum a todos os genes. Os efeitos de transcritos (G) e suas interações devem ser considerados como aleatórios. A interação de maior interesse é TGkm, a qual retrata o efeito do tratamento k sobre o nível de expressão do gene m. Esse modelo é relevante porque considera todos os efeitos simultaneamente em uma única análise. No entanto, apresenta a desvantagem de considerar uma variância residual comum a todos os genes. O uso do método de quadrados mínimos na análise de dados de microarrays, considerando todos os transcritos simultaneamente, apresenta restrições devido ao elevado número de genes em relação ao número de lâminas, ou seja, maior número de efeitos a estimar do que número de observações amostrais. Isso conduz a problemas de estimação para modelar covariâncias entre níveis de expressão de vários genes, devido ao reduzido número de graus de liberdade. A alternativa a ser adotada refere-se ao uso dos estimadores do tipo shrinkage para os componentes de variância.9 Alguns experimentos podem fazer uso de várias sondas dentro de um arranjo, e um modelo no nível de observações em cada sonda (S) pode ser ajustado para cada gene. Para tanto, o seguinte modelo pode ser considerado:

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yijkm = u + Ai + Dj + ADij + Sm + Tk + TSkm + eijkm, em que o efeito de sonda é aleatório, assim como o termo da interação (TSkm) Nos testes de significância dos efeitos do modelo, os p-valores necessitam ser ajustados quando múltiplos testes são realizados em um experimento, como no caso de milhares de transcritos testados simultaneamente – neste caso, por meio da correção de Bonferroni.10,11 Esta pode ser utilizada em situações em que se deseja realizar vários testes de hipóteses (intervalos de confiança) e controlar o nível de significância global. Para n intervalos simultâneos e mesmo nível de significância (D) em cada i-ésimo intervalo, o nível de significância global é: D * = D × n. Por exemplo, para n = 5 comparações, um nível global alfa (D) * = 0,05 só se garante se cada i-ésimo intervalo for construído ao nível de significância de D*/5 = 0,01. No caso de n intervalos individuais com diferentes níveis de significância, a significância global é dada por n D * = i =1 Di. Esse resultado vem diretamente da desigualdade de Bonferroni. Desde que se escon lha ∑ i =1 Di = D *, tem-se a garantia de um grau de confiança global de pelo menos 1–D *. Temse então o nível de significância corrigido D *= D/n, o qual é utilizado como referência para cada um dos testes. Essa abordagem é conservativa, diminui o poder dos testes e assume independência entre os intervalos de confiança estimados. Como já discutido, um critério mais apropriado para esse caso é a taxa de falso-positivos (FDR), a qual é definida como a proporção esperada de falso-positivos dentre todos os testes significativos.12 Dentre as ferramentas computacionais para a análise estatística de expressão gênica via microarrays, uma que apresenta destaque por ser livre (com códigos fonte abertos) e de rápida difusão cientifica é o R/Bioconductor.

∑

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A Acessibilidade cromatina-DNA para expressão gênica, 39 Ácido(s) - araquidônico, 284 - desoxicólico, 380 - desoxirribonucleico, 3 - fenólicos, 244, 250, 252 - fólico, 309 - graxos, 310 - - classificação de, 261 - - e expressão de genes promotores de marcadores inflamatórios, 283 - - insaturados - - - metabolismo hepático de lipídios, 274 - - - tecido adiposo, 275 - - livres, doenças cardiovasculares e, 352 - - monoinsaturados, 265 - - - desenvolvimento da placa aterosclerótica, 272 - - - diabetes, 291 - - - doenças cardiovasculares, 291 - - - inflamação nas doenças crônicas não transmissíveis, 291 - - - lipoproteínas plasmáticas, 269 - - - obesidade, 291 - - - resistência à insulina, 291 - - - risco cardiovascular, 269 - - ômega 3 e proteômica, 336 - - poli-insaturados, 265, 294 - - - desenvolvimento da placa aterosclerótica, 272 - - - lipoproteínas plasmáticas, 269 - - - risco cardiovascular, 269 - - saturados, 261 - - - desenvolvimento da placa aterosclerótica, 271 - - - doenças cardiovasculares, 290 - - - inflamação nas doenças crônicas não transmissíveis, 285 - - - lipoproteínas plasmáticas, 267 - - - metabolismo hepático de lipídios, 274 - - - obesidade, 286 - - - resistência à insulina e diabetes, 289

- - - risco cardiovascular, 267 - - - tecido adiposo, 275 - - trans, 265 - - - desenvolvimento da placa aterosclerótica, 273 - - - lipoproteínas plasmáticas, 270 - - - metabolismo hepático de lipídios, 274 - - - risco cardiovascular, 270 - - - tecido adiposo, 276 Acilcarnitinas, 353 Adipocinas, 78 Adipocitocinas, 73 Aditivos da reação em cadeia da polimerase, 103 Alfacaroteno, 247 Alimentação não saudável, 62 Alterações genéticas e ocorrência de doenças em cardiologia, 171 Aminoácidos e alfa-hidroxibutirato, 353 Análise - de expressão gênica - - conceito de “repetição” na, 396 - - em experimentos de microarrays, 397 - - em experimentos de RNA-seq, 399 - - tecnologias para, 396 - dirigida, 342 - não dirigida, 342 Anelamento, 99 Anomalias cromossômicas, 11 Apigenina, 253 Apolipoproteínas, 182 Aspectos éticos na genômica nutricional, 389 Associação DNA-histonas, 6 Ativadores - de splicing exônicos, 26 - eucarióticos, 45 Avaliação da expressão gênica, 110

B Balanço energético, 137 Bases nitrogenadas, 5 Beneﬁcência, 389

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Betacaroteno, 245 Bioestatística na genômica nutricional, 395 - analítica ou inferencial, 395 - descritiva, 395

C Cálcio, 212 Câncer, 60, 76 - colorretal, 196, 371 - - cálcio, 214 - - gênese e correlação com a microbiota intestinal, 376 - - inflamação, 212 - - metabolismo de lipídios, 212 - - metabolismo de um-carbono, 201 - - metabolismo hormonal, 203 - - metabolismo redox, 209 - - papel dos receptores de reconhecimento padrão no, 381 - - pré-bióticos e probióticos, 381 - - selênio, 233 - - sinalização celular, 203 - - vitamina D, 214 - - xenobióticos, 209 - de mama, 195 - - cálcio, 212 - - inflamação, 210 - - metabolismo de lipídios, 210 - - metabolismo de um-carbono, 199 - - metabolismo hormonal, 202 - - metabolismo redox, 205 - - selênio, 231 - - sinalização celular, 202 - - vitamina D, 212 - - xenobióticos, 205 - - zinco e, 236 - de próstata, 196 - - cálcio, 213 - - inflamação, 211 - - metabolismo de lipídios, 211 - - metabolismo de um-carbono, 200 - - metabolismo hormonal, 203 - - metabolismo redox, 207

Índice

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402 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis - - selênio, 232 - - sinalização celular, 203 - - vitamina D, 213 - - xenobióticos, 207 - - zinco e, 237 - selênio e, 230 Carcinogênese, 193 Cardiologia - alterações genéticas e ocorrência de doenças em, 171 - identificação de polimorfismos em estudos de nutrigenética na, 170 - interação gene-nutriente em, 180 Cardiopatia isquêmica, 172, 180 Carotenoides, 243-245, 247 Centrômeros, 9, 12, 14 Citocinas, 70, 78 Citogenética, 11 COBRA, 120 Coenzima Q 10 e proteômica, 337 Cofatores, 103 Colite ulcerativa, 371 Compostos fenólicos, 249 Controle - pós-recrutamento de Pol II, 49 - pós-transcricional, 37, 50 - transcricional, 37, 38 Corpos cetônicos, 353 Criptoxantina, 247 Cromatina, 2, 39 Cromatografia - a gás, 345 - a líquido de alta eficiência, 346 Cromossomos, 1, 9, 84 Curcumina, 245, 254

D Desaminação hidrolítica, 116 Desnaturação, 99 Dessulfonação alcalina, 116 Diabetes melito, 58, 159 - ácidos graxos monoinsaturados, 291 - ácidos graxos ômega-3 e ômega-6, 295 - microbiota e, 361 - modulação da microbiota intestinal, 362 - nutrigenética e, 159, 160 - tipo 1, microbiota e, 362 - tipo 2, 72, 159 - - microbiota e, 361 - - selênio e, 228 - - zinco e, 235 Dieta hiperlipídica e proteômica, 334 Dislipidemias, 174, 182 DNA, 1, 3, 21, 84 - estrutura, 3 - molde (template), 101 - transpósons de, 14 DNA-polimerases, 18, 102 Doença(s) - arterial coronariana, 169 - cardiovasculares, 59, 74, 169 - - ácidos graxos - - - monoinsaturados, 291 - - - ômega-3 e ômega-6, 295

- - - saturados e, 290 - - metabolômica e, 341, 350 - - microbiota e, 364 - - - bucal e, 364 - - - intestinal e, 365 - - modulação da microbiota intestinal, 366 - - selênio e, 229 - - zinco e, 236 - crônicas não transmissíveis, 57, 58 - - ácidos graxos e inflamação nas, 285 - - fatores de risco para, 61 - - - modificáveis, 61 - - - não modificáveis, 64 - - inflamação e estresse oxidativo no desenvolvimento das, 67 - - microbiota nas, 357 - - prevalência das, 58 - - programação fetal e, 303 - - proteômica como biomarcadores nas, 329 - de Crohn, 371 - inflamatórias intestinais, 371 - - genômica e, 375 - - microbiota - - - e sistema imune, 374 - - - e suscetibilidade genética nas, 374 - - papel da microbiota nas, 372 - mentais, 60 - respiratórias crônicas, 60

E Elagitanino, 251, 252 Elementos de transposição, 14 Eletroforese - bidimensional, 330, 331 - capilar, 347 - - com detecção por espectrometria de massas, 343 Epicatequinas, 252 Epigenética, 84, 90 Escherichia coli, 373 Espectrometria de massas, 330, 348 Estresse oxidativo, 67, 74 - na obesidade, 71 Estudos de associação - epigenômica ampla, 316 - genômica ampla, 316 Etapas limitantes da transcrição, 47 Eucariotos - multicelulares, 37, 38 - superiores, 37 Eucromatina, 7, 39 Exportação nuclear dos mRNA, 29 Expressão gênica, 37 Extensão, 99

F Faecalibacterium prausnitzii, 373 Fase de alongamento, 24 - da tradução, 33 Fat mass and obesity-associated, 150 Fator(es) - de crescimento endotelial vascular, 67

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- de inibição da migração de macrófagos, 77 - de interação, 46 - de transcrição IIA (TFIIA), 24 Fenilcetonúria, 86 Fenótipo, 84 Fitatos, 244, 248 Flavonoides, 244, 250, 253 Fome Holandesa, 304, 306 Forquilha de replicação, 16 Fosforilação, 334

G Gene(s), 84, 141, 177, 322 - ABCA1, 177, 323, 323 - ADIPOQ, 322 - ADRB, 141 - ANGPTL4, 177 - BMAL1, 322 - CETP, 177 - CLOCK, 322 - CYP7A1, 177 - envolvidos no metabolismo lipídico/de lipoproteínas, 183 - FTO, 141, 161 - GAB1, 323 - GCK, 323 - GHRL, 141 - HNF4α, 322 - HTR2A, 323 - INS, 322 - IRS2, 323 - KSR2, 142 - LCAT, 177 - LDLRAP1, 177 - LIPC, 177, 323 - LPL, 177 - NOS3, 181 - PCSK9, 177 - PER2, 322 - PFKFB3, 323 - PHOSPHO1, 323 - PLTP, 323 - PPARA, 177 - PPARB, 177 - PPARG, 141, 177 - PPARGC-1α, 322 - PTPRJ, 323 - RAP1, 142 - SLC30A8, 323 - SOCS3, 323 - SREBF1, 323 - SREBP-1c, 177 - TNFα, 322 - TXNIP, 323 - UCP1, 141 - UCP2, 141 - UCP3, 141 Genética molecular, 5 Genoma, 1, 84 Genoma Humano, Projeto, 84 Genômica nutricional, 83, 84 - aspectos éticos na, 389 - bioestatística na, 395

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- conceitos e princípios da, 84 - doenças inflamatórias intestinais e, 375 Glicemia de jejum alterada, 322 Glicolipotoxicidade, 73 Grelina, 150 GWAS (genome-wide association studies), 84

H Haploides, 9 Hereditariedade, 64 Heterocromatina, 7, 39 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A redutase (HMG-CoA redutase), 247 Hiperglicemia, 73, 311 Hipertensão arterial sistêmica, 176, 186 Hipertrigliceridemia, 322 Hipóxia, 70 Histonas, 40, 84 - modificação de, 130 Hot start PCR, 103

I Idade, 64 Identificação de polimorfismos em estudos de nutrigenética na cardiologia, 170 IL-6, 77 Imunoensaios, 124 Imunoprecipitação de cromatina, 47 Inatividade física, 61 Inflamação, 67, 71, 209 - crônica, 284 - subclínica - - associada à obesidade, 72 - - e biomarcadores, 284 Inflamassomos, 298 Iniciação da transcrição, 23 Início da tradução, 32 Interação gene-nutriente em cardiologia, 180 Isoflavonas da soja e proteômica, 336

J Justiça, 389

K Kaempferol, 253

L Leptina, 144 Licopeno, 247 Lipidômica, 89 Lipoproteína(s) - de alta densidade, 322 - de baixa densidade, 74 - de muito baixa densidade, 74 - plasmáticas e ácidos graxos, 267 Lócus, 10, 84 Luteína, 245 Luteonina, 253

M Magnésio, 103 Marcador de estresse oxidativo, 79

Maresinas, 297 Mass spectrometry methylation assay (MassARRAY assay), 121 Matriz de microarranjo, 110 Mecanismos epigenéticos na programação fetal, 307 Metabolismo - de lipídios, 209, 265 - de lipoproteínas, 265 - de um-carbono, 197 - hepático de lipídios, 273 - hormonal, 201 - redox, 204 Metabólitos relacionados com as doenças cardiovasculares, 352 Metabolômica, 89, 93, 341 - nas doenças cardiovasculares, 350 - técnicas analíticas empregadas em, 345 Metagenômica, 90 Methylation-sensitive PCR (MSP), 122 Methylation-sensitive single-nucleotide primer extension assay (MS-SnuPE), 120 Metilação - do DNA, 42, 84 - - global (LINE-1), 317 - do gene TNFD, 316 Método(s) - de análise combinada de bissulfito e restrição (COBRA), 120 - de análises de genoma completo (genome-wide), 125 - de detecção de citosinas metiladas e não metiladas, 117 - de determinação de marcadores epigenéticos, 115 - de pré-tratamento do DNA, 116 Micro-RNA, 51 Microarranjos, 108 Microarrays, 93, 99 Microbioma, 84 Microbiota - desenvolvimento da, 358 - e diabetes, 361 - - tipo 1, 362 - - tipo 2, 361 - e doenças cardiovasculares, 364 - - microbiota bucal, 364 - - microbiota intestinal, 365 - e obesidade, 359 - na promoção e na prevenção das doenças intestinais, 371 - nas doenças inflamatórias intestinais, 372 Microssatélites, 86 Minerais, 308 Modelo dupla-hélice tridimensional da molécula de DNA, 4 Modificação(ões) - de histonas, 130 - pós-traducionais, 333 Modulação da microbiota intestinal, 376 - diabetes, 362 - doenças cardiovasculares, 366

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- obesidade, 360 Molécula de adesão, 79 MS-HRM, 120 MS-SnuPE, 120 Multiplex PCR, 104

N Não maleﬁcência, 389 Nested da reação em cadeia da polimerase, 103 NF-NB, 77 Nucleossomos, 39 NuGO (European Nutrigenomics Organisation), 94 Nutrição personalizada, 83, 91 Nutrigenética, 84, 86 - e câncer, 193 - e diabetes, 160 - na obesidade, 137 - na perda de peso, 137 - nas doenças cardiovasculares, 169 - no diabetes, 159 - selênio e, 225 - zinco e, 234 Nutrigenômica, 84, 87

O Obesidade, 68 - abdominal, 321 - ácidos graxos - - monoinsaturados e, 291 - - ômega-3 e ômega-6, 295 - - saturados e, 286 - estresse oxidativo na, 71 - inflamação subclínica associada à, 72 - microbiota e, 359 - modulação da microbiota intestinal, 360 - monogênica, 138 - (nutri)epigenética na, 316 - poligênica, 138 Ômega-3, 294, 295 Ômega-6, 294, 295 Orientação Nutricional Pessoal On-line, 94 Origens da replicação, 15 Oxirredução, 204

P Peptídios bioativos, 245, 255 Pirossequenciamento, 119 Placa aterosclerótica, 271 Polimorfismo, 84, 86 - de inserção ou deleção (INDELS), 86 - de nucleotídeo único, 86, 170 - do gene - - da adiponectina (ADIPOQ), 162 - - da apoproteína (APO), 163 - - da proteína transportadora de ácidos graxos 2 (FABP2), 162 - - do coativador 1-alfa do receptor ativado por proliferador de peroxissoma (PGC1A), 160 - - do receptor ativado por proliferador de peroxissoma GAMA (PPARG), 160

Índice 403

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404 Genômica Nutricional nas Doenças Crônicas Não Transmissíveis - - fat mass and obesity-associated (FTO), 161 - - transcription factor 7-like 2 (TCF7L2), 164 Pré-bióticos, 366, 376 Pressão arterial alterada, 322 Primers, 102 Proantocianidinas, 252 Probióticos, 366, 376 Processo inflamatório, 284 Produtos finais da glicação avançada, 73 Programação fetal, 303 - mecanismos epigenéticos na, 307 Promotores, 23 - eucarióticos, 44 - gênicos, 46 Protectinas, 297 Proteína(s), 6, 21, 310 - ativadoras e repressoras do início da transcrição em eucariotos, 44 - ATP2B1, 177 - de fase aguda, 78 - desacopladoras, 149 - p16/Ink4a (CDKN2A), 380 - TBP (TATA-binding protein), 24 Proteoma, 329 Proteômica, 84, 88, 329 - ácidos graxos ômega-3 e, 336 - coenzima Q10 e, 337 - isoflavonas da soja e, 336 - nutrição e risco cardiovascular, 334 - selênio e, 338

Q Quantificação - absoluta, 107 - relativa, 106 Quimiocina, 79 Quinase supressora de Ras 2, 152

R Raça, 64 Randomly amplified polymorphic DNA, 103 Ras-proximate-1, 152 Ras-related protein 1, 152 Reação em cadeia da polimerase, 99 - componentes da, 101 - convencional, 99 - - variações da, 103 - de alta fidelidade (high-fidelity PCR), 104 - digital, 108 - em tempo real, 105 Reação redox, 204 Receptor(es) - ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR), 145 - beta2-adrenérgicos, 148 - de melanocortina 4 (MC4R), 143 Recrutamento de complexos proteicos, 45 Região - cromossômica 9p21, 180 - de constrição secundária, 9

Regulação da recrutamento da RNAPol II, 48 Replicação, 17 - origens da, 15 Réplicon, 18 Resistência à insulina - ácidos graxos - - monoinsaturados, 291 - - ômega-3 e ômega-6, 295 - - saturados, 289 Resolvinas, 297 Respeito à autonomia, 389 Ressonância magnética nuclear, 349 Resveratrol, 245, 253 Retrotranspósons, 14 Reverse transcription da reação em cadeia da polimerase, 104 Risco cardiovascular - e ácidos graxos, 267 - proteômica, nutrição e, 334 RNA, 1 - circulares, 53 - longos não codificadores, 50 - mensageiro (mRNA), 1, 22, 84 - não codificadores, 50 - não codificantes, 131 - ribossômico, 1 - transportador, 1 RNA-polimerase, 22, 24, 45

S Satélites, 9 Selênio - câncer, 230 - - colorretal, 233 - - de mama, 231 - - de próstata, 232 - diabetes melito tipo 2, 228 - doença cardiovascular, 229 - proteômica, 338 - nutrigenética, 225 Sequenciamento direto por bissulfito (BS-Seq), 118 Sexo, 64 Simbióticos, 376 Sinalização celular, 201 Síndrome - de Werner, 14 - metabólica - - e resveratrol, 253 - - (nutri)epigenética na, 315, 321 SNP (single nucleotide polymorphism), 84 Sociedade Internacional de Nutrigenética/Nutrigenômica, 94 Sorgo, 252 Splicing, 25 Subnutrição, 310 Sulfonação, 116 Supernutrição, 310

T Tabagismo, 61

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Tampão da enzima, 102 Taninos, 244, 250, 251 Tecido adiposo, 275 Técnica(s) - analíticas empregadas em metabolômica, 345 - de determinação e quantificação de metilação e hidroximetilação do DNA, 115 - de reação em cadeia da polimerase, 88 - methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM), 120 - MudPIT, 332 Tecnologia assistida de avaliação dietética, 94 Telomerase, 13, 14 Telômeros, 9, 13, 14 Terminação - da transcrição, 26 - do processo de tradução, 33 Testes genéticos - aceitação dos consumidores, 392 - direct-to-consumer (DTC), 92 - especificidade e confiança dos, 390 - indicação dos, 390 - interpretação, 391 - resultados, 392 Tradução, 30 - fase de alongamento da, 33 - início da, 32 - terminação do processo de, 33 Transcrição, 21, 22 - iniciação da, 23 - terminação da, 26 Transcriptômica, 88 Transpósons, 14

U Uso nocivo de álcool, 63 Utilidade prática/clínica, 391

V Validade - analítica, 391 - clínica, 391 Vitamina, 308 - D, 212

X Xantofilas, 245 Xenobióticos, 204

Z Zeaxantina, 245, 247 Zinco - e câncer de mama, 236 - e câncer de próstata, 237 - e diabetes melito, 235 - e doenças cardiovasculares, 236 - nutrigenética, 234 Zona SAT, 9

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