AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE PIGMENTOS PRODUZIDOS POR BACTÉRIAS DO GÊNERO Serratia by Espaço Científico Livre Projetos Editoriais

Raimundo Felipe da Cruz Filho Maria Francisca Simas Teixeira

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE PIGMENTOS PRODUZIDOS POR BACTÉRIAS DO GÊNERO Serratia ISOLADAS DE SUBSTRATOS AMAZÔNICOS

1ª edição - 2013

Raimundo Felipe da Cruz Filho Maria Francisca Simas Teixeira

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE PIGMENTOS PRODUZIDOS POR BACTÉRIAS DO GÊNERO Serratia ISOLADAS DE SUBSTRATOS AMAZÔNICOS 1ª edição

Duque de Caxias

2013

2013, Espaço Científico Livre Projetos Editoriais

Este conteúdo pode ser publicado livremente, no todo ou em parte, em qualquer mídia, eletrônica ou impressa, desde que:

b Atribuição. Você deve dar crédito, indicando o nome do autor e da Espaço Científico Projetos Editoriais, bem como, o endereço eletrônico em que o livro está disponível para download.

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Ficha Catalográfica C9574

Cruz Filho, Raimundo Felipe da; Teixeira, Maria Francisca Simas

aaaAvaliação do potencial biotecnológico de pigmentos produzidos por bactérias do gênero Serratia isoladas de substratos amazônicos / Raimundo Felipe da Cruz Filho; Maria Francisca Simas Teixeira – Duque de Caxias, 2013. aaa1,76 MB; il.; PDF aaaISBN 978-85-66434-04-0 aaa1. Pigmento. 2. Biotecnologia. I. Avaliação do potencial biotecnológico de pigmentos produzidos por bactérias do gênero Serratia isoladas de substratos amazônicos. II. Cruz Filho, Raimundo Felipe da. III. Teixeira, Maria Francisca Simas. CDD 570 __________________________________________________________________________ Autores: Raimundo Felipe da Cruz Filho e Maria Francisca Simas Teixeira Revisão: Verônica C. D. da Silva Capa: Verano Costa Dutra / Imagem: Centers for Disease Control and Prevention – CDC / Wikipédia Coordenador: Verano Costa Dutra Editora: Monique Dias Rangel Dutra Espaço Científico Livre Projetos Editoriais é o nome fantasia da Empresa Individual MONIQUE DIAS RANGEL 11616254700, CNPJ 16.802.945/0001-67, Duque de Caxias, RJ espacocientificolivre@yahoo.com.br / http://issuu.com/espacocientificolivre

sta obra foi originalmente publicada como Dissertação apresentado Programa Multi-Institucional de Pós-Graduação em Biotecnologia Universidade Federal do Amazonas, como parte do requisito para obtenção título de Mestre em Biotecnologia, área de concentração Saúde, sob a orientação Profª. Dra. Maria Francisca Simas Teixeira, em 21 de fevereiro de 2006.

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Banca examinadora da dissertação: Profª. Dra. Maria Francisca Simas Teixeira Universidade Federal do Amazonas – UFAM Profª. Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto Universidade Federal Rual de Pernambuco – UFRPE Dra. Waldirene Caldas Rocha Centro de Biotecnologia do Amazonas – CBA

DEDICATÓRIA

Ao meu pai (in memoriam), minha mãe e a minha orientadora, pelo auxílio, incentivo e apoio na realização deste Trabalho.

AGRADECIMENTOS

À Deus e Nossa Senhora por terem me conduzido este trabalho;

À minha orientadora pelo acompanhamento e dedicação;

Aos amigos Ormezinda C. O. Fernandes, Takeshi Matsuura, Januário G. Santos que auxiliaram e participaram das alegrias e também dos momentos mais turbulentos na realização deste trabalho;

Ao amigo Diego de Moura Rabelo pelas análises de espectrometria de infravermelho;

À minha família que está sempre junta seja na alegria ou na tribulação.

Se ficaram mágoas em mim, Mãe tira do meu coração! E aqueles que eu fiz sofrer peço perdão! Se eu curvar meu corpo na dor me alivia o peso da cruz! Interceda por mim minha Mãe junto a Jesus! Roberto Carlos

RESUMO

xistem diversos pigmentos naturais, principalmente de origem vegetal (flores, frutos, folhas e raízes), mas poucos estão disponíveis para aproveitamento industrial, pois são de difícil extração, custo elevado no processo de extração ou toxicidade considerável para o homem ou meio ambiente. A atual tendência por produtos naturais promove o interesse em explorar novas fontes para a produção biotecnológica de pigmentos para aplicação na indústria. Este trabalho teve como objetivo a identificação de espécies de Serratia, e entre estas, selecionar uma produtora de maior quantitativo de pigmentos de importância para a indústria alimentícia e farmacêutica. Foram analisados 12 isolados de bactérias de coloração vermelha, com características do gênero Serratia. As culturas foram identificadas como Serratia marcescens utilizando-se o Kit API 20E (BioMérieux). Entre os diferentes isolados de S. marcescens analisados, 100% das bactérias exibiram pigmentação vermelha, em Agar Nutritivo. A idade do inóculo que proporcionou obtenção de maior produção de pigmento foi o de 24 horas de crescimento com 8,106 μg/mL. As melhores condições de fermentação foram 28 ºC, pH 7 e 300 rpm, quando a produção máxima de pigmento obtida foi 8,493 μg/mL de meio (Caldo Nutritivo). Entre os meios de cultura analisados, S. marcencens FS3 produziu, em média, o maior quantitativo de pigmento em Caldo Nutritivo (7,945 μg/mL). A análise do fermentado de S. marcencens FS3 através de cromatografia em camada delgada, utilizando-se como fase móvel hexano/acetato de etila/metanol 3:4:3 (v/v/v) apresentou uma única mancha de coloração roxa quando exposta a luz branca, apresentando Rf de 0,6 e quando exposto a luz ultravioleta com comprimento de onda de 365 nm apresentou três bandas com valores de Rf de 0,5; 0,6 e 0,7. No espectro de infravermelho observou-se características de alcaloides, que sugerem a presença da prodigiosina. Os resultados mostram a necessidade da realização de investigação do tipo RMN-1H e outras análises para a confirmação da presença de prodigiosina.

ABSTRACT

here are several natural pigments, mainly of plant origin (flowers, fruits, leaves and roots), but few are available for industrial use because they are of difficult extraction, high cost in the extraction process or high toxicity for human or environment. Current tendency for natural ingredients promoted the interest in exploring new sources for the biotechnological production of pigments for application in the industry. This work had as objective the identification of species of Serratia, and among these, to select a pigment-producing of larger quantitative of importance for food and pharmaceutical industry. Were analyzed twelve isolated of bacteria of red coloration, with characteristics of Serratia genus. The cultures were identified as Serratia marcescens by API 20E Kit (BioMérieux). Among the different ones isolated of S. marcescens analyzed, 100% of the bacteria exhibited red pigmentation, in solid medium. The age of inoculum that provided the larger quantitative of pigment was at 24 hours of growth. Best fermentation conditions were 28 ºC, pH 7 and 300 rpm, when the maximum production of pigment obtained was 8,493 μg/mL. Among the culture media tested, S. marcescens FS3 produced, on average, the largest quantitative of pigment in nutritive broth. Fermented broth of S. marcescens FS3 was carried out by thin layer chromatography, and the mobile phase used was hexane/ethyl acetate/methanol 3:4:3 (v/v/v) and the chromatogram presented only a purple coloration (Rf 0,6) when exposed to white light and when exposed to ultraviolet light at wavelength of 365 nm presented three bands (Rf 0,5; 0,6 and 0,7) characteristic of prodigiosin. Infrared spectrum showed characteristic of alkaloids suggesting the presence of prodigiosin. Results show the need of the accomplishment of investigation of the type 1H-NMR and other analyses for confirmatory presence of prodigiosin.

LISTA DE FIGURAS Figura 01 – Esquema demonstrando o somatório do bipirrol e monopirrol formando o pigmento prodigiosina

Figura 02 – Reativação das culturas por semeadura em superfície

Figura 03 – Manutenção de células viáveis a 4 ºC em tubos de ensaio

Figura 04 – Manutenção de células viáveis a -20 ºC em tubos do tipo Eppendorf

Figura 05 – Extrato da fermentação obtido com diclorometano

Figura 06 – Característica de S. marcescens corada pelo Método de Gram (bastonetes Gram negativos)

Figura 07 – Cultura de S. marcescens obtida em 24 h, a 37 ºC , em ágar nutritivo, apresentando pigmento não difusível

Figura 08 – Pigmento vermelho produzido por S. marcescens em caldo nutritivo, por fermentação submersa, a 28 ºC, 300 rpm por 24 horas

Figura 09 – Atividade antimicrobiana de S. marcescens contra (A) Escherichia coli, (B) Staphylococcus aureus, (C) Candida albicans, (D) Mycobacterium smegmatis

Figura 10 – Espectro no infravermelho da fração diclorometano

LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 - Crescimento de S. marcescens relacionado à produção de pigmento em 50 mL de caldo nutritivo por 28 ºC, 300 rpm

Gráfico 2 – Produção de pigmento em µg/mL relacionado à idade do inoculo (12h e 24h) em caldo nutritivo

Gráfico 3 – Parâmetros que proporcionaram a produção de maior quantitativo de pigmento por S. marcescens (agitação de 300 rpm; pH 7, 8 e 9; temperatura de 28 ºC e 30 ºC)

LISTA DE EQUAÇÕES Equação 1 – Cálculo para determinação da produção de prodigiosina por mL de Caldo Nutritivo

LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Diferenciação Bioquímica da Família Enterobacteriaceae

Tabela 2 – Número de bactérias estudadas, códigos, características macroscópicas e morfo-tintorial e substrato de origem

Tabela 3 – Microrganismos-teste analisados contra S. marcescens

Tabela 4 – Quantitativo de prodigiosina produzido por 12 isolados de S. marcescens em caldo nutritivo, a 28 ºpor 24 horas, a 300 rpm

Tabela 5 – Características de S. marcescens FS3 relacionadas aos fatores de patogenicidade

Tabela 6 – Parâmetros que influenciaram na produção de prodigiosina em diferentes condições de fermentação: agitação, pH e temperatura, 24 horas de incubação

Tabela 7 – Quantitativo de pigmento produzido por S. marcescens FS3 em diferentes meios de cultura, a 28 ºC, pH 7, a 300 rpm. 24 horas de incubação

Tabela 8 – Halo de inibição apresentado pelo antagonismo entre Serratia marcescens FS3 frente os microrganismos-teste pelo método do Bloco de Gelose

SUMÁRIO CAPÍTULO 1 ......................................................................................................... 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................

17 17

CAPÍTULO 2 ......................................................................................................... 2. REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................... 2.1. PIGMENTOS ................................................................................................ 2.2. GÊNERO Serratia ......................................................................................... 2.3. PIGMENTOS PRODUZIDOS POR Serratia .................................................

18 18 18 19 20

CAPÍTULO 3 ......................................................................................................... 3. METODOLOGIA ............................................................................................. 3.1. MICRORGANISMOS E MANUTENÇÃO DAS CULTURAS ..................... 3.2. REATIVAÇÃO DAS AMOSTRAS DE Serratia .......................................... 3.3. IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Serratia .......................................... 3.4. PRODUÇÃO DE PIGMENTO PELOS 12 ISOLADOS DE Serratia marcescens EM MEIO SÓLIDO ........................................................................... 3.5. SELEÇÃO DA ESPÉCIE PRODUTORA DE MAIOR QUANTITATIVO DE PIGMENTO ........................................................................................................... 3.5.1. FERMENTAÇÃO SUBMERSA: PRODUÇÃO DE PIGMENTOS ............. 3.5.2. QUANTIFICAÇÃO DO PIGMENTO PRODUZIDO POR Serratia ............. 3.6. CRESCIMENTO DA ESPÉCIE DE Serratia SELECIONADA RELACIONADO À PRODUÇÃO DE PIGMENTO ............................................... 3.7. DETECÇÃO DE FATORES DE PATOGENICIDADE DA ESPÉCIE SELECIONADA .................................................................................................... 3.8. ANÁLISE PARA IDENTIFICAÇÃO DOS FATORES QUE INFLUENCIAM NA PRODUÇÃO DE PIGMENTO ......................................................................... 3.8.1. DETERMINAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA IDADE DO INÓCULO ............. 3.8.2. EFEITO DA TEMPERATURA, pH E AGITAÇÃO ...................................... 3.8.3. SELEÇÃO DO MEIO DE PRODUÇÃO DO PIGMENTO .......................... 3.9. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA (MÉTODO DO BLOCO DE GELOSE) .......................................................................................... 3.10. EXTRAÇÃO DO PIGMENTO (DICLOROMETANO) ................................. 3.10.1. ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DA FRAÇÃO DICLOROMETANO ...... 3.10.2. ANÁLISE DE ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO DA FRAÇÃO DICLOROMETANO ....................................................................... 3.11. ANÁLISE ESTATÍSTICA ...........................................................................

22 22 22 22 24

4. RESULTADOS ................................................................................................ 4.1. IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Serratia .......................................... 4.2. DETECÇÃO DA PRODUÇÃO DE PIGMENTO POR ISOLADOS DE Serratia marcescens EM MEIO SÓLIDO ........................................................... 4.3. SELEÇÃO DA ESPÉCIE DE Serratia PRODUTORA DE MAIOR QUANTITATIVO DE PIGMENTO ......................................................................... 4.4. CARACTERIZAÇÃO DE S. marcescens FS3 ............................................. 4.4.1. DETECÇÃO DE FATORES DE PATOGENICIDADE ............................... 4.4.2. CRESCIMENTO DE S. marcescens FS3 RELACIONADO A PRODUÇÃO DE PIGMENTO ..................................................................................................... 4.5. ANÁLISE PARA IDENTIFICAÇÃO DOS FATORES QUE INFLUENCIAM NA PRODUÇÃO DE PIGMENTO ......................................................................... 4.5.1. DETERMINAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA IDADE DO INÓCULO ...............

30 30

24 24 25 25 25 25 26 26 27 27 27 28 28 28 29

30 31 32 32 33 34 34

4.5.2. EFEITO DA TEMPERATURA, pH E AGITAÇÃO NA PRODUÇÃO DE PIGMENTO ........................................................................................................... 4.5.3. SELEÇÃO DO MEIO DE PRODUÇÃO DO PIGMENTO .......................... 4.6. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE S. marcescens FS3 CONTRA BACTÉRIAS E LEVEDURA DE IMPORTÂNCIA MÉDICA ................................. 4.7. ANÁLISE EM CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA E ESPECTROMETRIA DE INFRAVERMELHO ...................................................... 4.7.1. ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DO EXTRATO DA FRAÇÃO DICLOROMETANO .............................................................................................. 4.7.2. ANÁLISE DE ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO DA FRAÇÃO DICLOROMETANO .......................................................................

35 36 37 37 37 38

CAPÍTULO 5 ........................................................................................................ 5. CONCLUSÕES ..............................................................................................

39 39

REFERÊNCIAS

....................................................................................................

.........................................................................................................

APÊNDICE

CAPÍTULO 1 CAPÍTULO 1

1. INTRODUÇÃO

Amazônia é uma região tropical onde ocorre grande diversidade de microrganismos em função da alta umidade, precipitação e temperaturas elevadas. Fazendo parte dessa diversidade microbiana, as bactérias e os fungos constituem uma biomassa diversificada entre os quais inúmeras espécies produzem metabólitos secundários, tais como enzimas, antibióticos, vitaminas, aminoácidos e pigmentos de grande potencial para aplicação nas indústrias de alimento, farmacêutica, têxtil, química e de cosméticos (DURAN et al.,2002). Pereira (2005) e Albagli (2001) concordam que a grande diversidade biológica Amazônica associada a pesquisa aplicada à produção de produtos e processos biotecnológicos propiciará um novo ciclo de desenvolvimento econômico e social na região. Pigmentos específicos são produzidos por uma grande diversidade de microrganismos como os fungos e as bactérias. Esses biocompostos exibem várias atividades biológicas, além de citotoxidade, a exemplo da Serratia marcescens e os actinomicetos (MARGALITH, 1992; MATSUURA, 1998; MONTANER; PÉREZ-TOMÁS, 2001; SOTO-CERRADO et al., 2004; DURAN et al.,2002). A indústria de corantes vem sofrendo, atualmente, com o aumento nos custos das matérias-primas e recursos energéticos para síntese de pigmentos, além do desafio crescente para minimizar os danos ao meio ambiente. Nesse contexto, a indústria busca continuamente novas vias aceitáveis ecologicamente e de menor custo na obtenção de pigmentos. Uma das estratégias para o Brasil seria a aplicação de metodologias biotecnológicas que viabilizem a biodiversidade Amazônica (MORITZ et al., 2001). Teng e Feldheim (2000, 2001) citam que a indústria de corantes naturais apresenta um crescimento de 5-10% em relação aos 3-5% dos obtidos por via sintética. A obtenção de pigmentos por via microbiana mostra-se vantajosa devido aos níveis de rendimentos dos processos fermentativos. Acredita-se, ainda, que após a realização das análises toxicológicas necessárias e sua comparação com os corantes sintéticos e de outras fontes naturais, os pigmentos microbianos poderiam ter uma aceitação maior pelos consumidores, por estarem associados com a imagem de produtos naturais, salutares e de boa qualidade. Considerando a diversidade de microrganismos na Região Amazônica, esta pesquisa tem como objetivos, selecionar espécies de Serratia produtoras de pigmentos de interesse industrial, identificar em nível de espécie; selecionar uma linhagem de melhor produtividade de pigmentos; e avaliar o crescimento bacteriano associado a produção de pigmentos em fermentação submersa, avaliar a produção de pigmentos em diferentes condições de fermentação submersa e verificar a atividade antimicrobiana frente a microrganismos de interesse clínico.

CAPÍTULO 2 CAPÍTULO 2

2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. PIGMENTOS

igmento (latim = pigmentum) são substâncias de composição química e cores próprias, de origem orgânica e/ou inorgânica, amplamente distribuídas na natureza, encontradas nas células e tecidos, sob a forma de grânulos, alguns com importantes funções, mas que em determinadas circunstâncias podem constituir causa ou efeito de alterações funcionais (CRUZ, 2000; VASCONCELOS, 2000). A diferença básica entre pigmentos e corantes está no tamanho de partícula e na solubilidade no meio em que é inserido. [...] A solubilidade de um determinado colorante pode ser determinada pela presença de certos grupos químicos na estrutura do composto, os quais podem ocasionar as diferenciações entre pigmentos e corantes. Em muitos casos, um colorante pode atuar como pigmento para um determinado polímero e como corante para outro. Isto ocorre porque a solubilidade depende diretamente da interação existente entre as moléculas do colorante e do polímero (SARON; FELISBERTI, 2006).

Atualmente os pigmentos comercializados apresentam origem orgânica ou inorgânica e a utilização destes produtos pelo homem sugerem datação superior ao período neolítico. Há registros de aproximadamente 4.000 anos que tecidos coloridos foram encontrados em múmias no Egito, todavia o uso de pigmentos em alimentos data de pelo menos 3.500 anos (PAGÈS-CAMAGNA; COLINART, 2003). Pigmentos também foram utilizados em inscrições rupestres no semiárido brasileiro, onde lascas de pedra pintada tiveram a idade mínima estimada em 31.500 anos, e em cavernas na África do Sul as datações superam 70 mil anos. Tais pigmentos utilizados historicamente pela humanidade foram obtidos de fontes naturais. O uso de corantes artificiais só iniciou-se no final do século XVIII (ALBUQUERQUE; LUCENA, 1991; BARNETT; MILLER; PEARCE, 2005). No último século foram sintetizados milhões de compostos químicos coloridos, dentre os quais aproximadamente 10 mil são produzidos em escala industrial. Entretanto, estima-se que 2 mil destes corantes são utilizados pela indústria têxtil (GUARATINE; ZANONI, 2000). A pesquisa e a produção de corantes e pigmentos naturais começaram a ter maior comercialização a partir do impedimento oficializado pelos órgãos ligados a vigilância sanitária aos corantes sintéticos para a produção de alimentos e medicamentos. O Codex Alimentarius, órgão da Organização Mundial da Saúde (OMS), já fundamentou o não uso de alguns corantes via ministérios da saúde de diversos países, tais como o amarelo sólido (empregado em gelatinas); o laranja GGN (usado em sorvetes); o vermelho sólido (recheios e revestimentos de biscoitos); o azul de alizarina (óleos emulsionados e gelatinas); e o escarlate GN no uso em recheios de confeitarias (FURTADO, 2004). Furtado (2004) afirma ainda que a Food and Agriculture Organization (FAO) permite apenas a comercialização de oito pigmentos sintéticos e cinco sintéticos de estrutura idêntica aos naturais.

A produção de pigmentos naturais pode também ser operacionalizada por fermentação utilizando diferentes espécies de microrganismos. No caso das bactérias, os biopigmentos podem ser excretados pelas células e/ou armazenados em seu interior, a exemplo de Serratia, bactéria produtora de pigmentos de interesse biotecnológico (HADDIX; WERNER, 2000; HOLT et al.,1994; MARGALITH, 1992).

2.2. GÊNERO Serratia

erratia são bactérias que pertencem a Família Enterobacteriaceae que apresentam forma de bastonetes de aproximadamente 0,5e 0,9-2 µm de comprimento, com flagelos peritríquios e Gram-negativa (GRIMONT; GRIMONT, 1992; HOLT et al.,1994). As espécies de Serratia são quimiorganotróficas, anaeróbios facultativos, apresentam crescimento em pH 7 a 9 e são mesófilas (HOLT et al.,1994). Outra característica fisiológica de Serratia está relacionada à produção de pigmento vermelho, além das citadas na tabela 1, que as diferenciam dos demais gêneros das Enterobacterias (HADDIX; WERNER, 2000; HOLT et al.,1994; MURRAY et al., 2002).

Tabela 1 – Diferenciação Bioquímica da Família Enterobacteriaceae: VP= Voges-Proskauer. VM= Vermelho de Metil. FDA ou TDA= Fenilalanina ou Tripitofano-desaminase. LDC= Lisinadescaboxilase. ODC= Ornitina-descaboxilase. ONPG= Ortonitrofenil- -D-galactopiranoside. + = positivo em 1-2 dias. – = Negativo. t = tardiamente ou irregularmente positivo. (+) = Positivo tardio, mais de 3 dias. d = Diferentes tipos bioquímicos. * exceto Serratia fonticola. Fonte: BIER (1985); HOLT et al. (1994)

Serratia tem habitat bastante diferenciado, são encontradas em água doce ou salgada, poluída ou impoluta, no solo promovendo o ciclo biológico de metais (ouro, ferro,

cobre), e a mineralização desses elementos (GRIMONT; GRIMONT, 1992). As espécies de Serratia são também encontradas em plantas, ocorrendo como epifíticas ou endofíticas, de hábito comensal ou parasita. Ocorrem também associações mutualistas e parasitárias com insetos das ordens: Orthoptera, Isoptera, Coleoptera, Lepidoptera, Hymenoptera, Diptera (AZAMBUJA et al., 2004; GRIMONT; GRIMONT, 1992). Serratia são microrganismos oportunistas que podem causar patologias, sendo S. marcescens a única que parasita o homem causando infecção no trato urinário e respiratório. Outras espécies como S. liquefaciens, S. odorifera e S. rubidaea são ocasionalmente isolados de amostras clínicas, mas, seu envolvimento em processos patológicos não foi esclarecido (AZAMBUJA et al., 2004; BREMER; DASONICHE, 2005; GRIMONT; GRIMONT, 1992; HOLT et al.,1994; MENEZES et al., 2004).

2.3. PIGMENTOS PRODUZIDOS POR Serratia

entre os metabólitos secundários produzido por Serratia spp., destaca-se o tripirrol linear (2-metil-3-amil-6-metoxiprodigiosena), formado a partir de dois percussores do tipo mono (2-metil-3-amilpirrol) e bipirrol (4-metoxi-2,2'-bipirrol5-carboxialdeido) que são sintetizados, separadamente, e posteriormente condensados por ação de enzimas formando prodigiosina, pigmento vermelho produzido em condições de aerobiose (DING; WILLIAMS,1983; GOLDSCHMIDT; WILLIAMS, 1968; PARUCHURI; HARSHEY,1986; WANG et al., 2004; MANDERVILLE, 2001)(Figura 1).

Figura 1 – Esquema demonstrando o somatório do bipirrol e monopirrol formando o pigmento prodigiosina Fonte: Ohkuma et al. (1998)

Prodigium, metabólito secundário da família dos alcaloides que apresenta características polivalentes, apresentando atividade antibacteriana, antifúngica, antitumoral, citotóxico, biossurfactante e imunossupresor (MANDERVILLE, 2001; SATO-CERRADO et al., 2004; SOMEYA et al., 2004; WASSERMAN; VU, 1990). Prodigiosina, pigmento vermelho produzido por Serratia marcescens promove apoptose em conjuntos de células com câncer hematopoiéticos e gastrointestinal, sem apresentar porém toxicidade nas células sadias (MONTANER; PÉREZ-TOMÁS, 2002; SATO-CERRADO et al., 2004). Prodigiosina apresenta características surfactante, ou seja, pode diminuir a tensão superficial na interface água-hidrocarboneto, podendo ser utilizada na biorremediação de solo e ambientes aquáticos, pois apresentam principalmente baixa toxicidade além da biodegradabilidade de compostos complexos em produtos mais simples que possam facilmente ser degradados pela natureza (CUNHA et al., 2004). Nas Serratia, prodigiosina só é produzido por linhagens de S. marcescens, S. plymuthica e S. rubidaea (DAUENHAUER et al., 1984). S. marcescens do biótipo A4 sintetizam um pigmento rosa extracelular chamado pirimina, ou ferrorosamina A, é um complexo ferroso de ácido de L-2(2-piridil)-D'pirrolina-5-carboxílico, um metabólito secundário também produzido por Erwinia rhapontici (FEISTNER et al., 1983; GRIMONT; GRIMONT, 1992; MARGALITH, 1992; TRIAS et al.,1988; WILLIAMS; QADRI, 1980). Outro biocomposto extracelular, o ácido 2-hidroxi-5-carboxi-metil-mucônico, pigmento amarelo, produzido a partir da clivagem do ácido 3,4-dihidroxi-fenilacético (3,4-DHP) pela enzima 3,4-DHP 2,3-dioxigenase (MARGALITH, 1992; TRIAS et al., 1988; WILLIAMS; QADRI, 1980).

CAPÍTULO 3 CAPÍTULO 3

3. METODOLOGIA 3.1. MICRORGANISMOS E MANUTENÇÃO DAS CULTURAS

este estudo foram analisadas 12 isolados de bactérias de coloração vermelha, com características do gênero Serratia, isoladas de diferentes substratos, cedidas pelo Centro de Pesquisa Leônidas e Maria Deane/Fiocruz/AMCPqLMD (FS) e Universidade Federal do Amazonas-UFAM (US), (Tabela 2). As amostras de Serratia estavam preservadas em tubo de ensaio em ágar nutritivo inclinado (15 x 160 mm), a 4 ºC.

Tabela 2 – Número de bactérias estudadas, códigos, características macroscópicas e morfotintorial e substrato de origem

3.2. REATIVAÇÃO DAS AMOSTRAS DE Serratia

s isolados de Serratia foram reativados, por semeadura em superfície, em ágar nutritivo (Apêndice: A), contido em placa de Petri (BIER, 1985; HOLT et al., 1994) (Figura 2). As culturas, em triplicata, foram mantidas a 37 ºC, por 24 horas (MURO; LUCHI, 1989). Seguido a esse processamento, as culturas foram obtidas para manutenção de células viáveis a 4 ºC e -20 ºC, em tubo de ensaio (15 x 160 mm) e em tubo do tipo Eppendorf contendo glicerol 20% (v/v), respectivamente (Figura 3 e 4).

Figura 2 – Reativação das culturas por semeadura em superfície

Figura 3 – Manutenção de células viáveis a 4 ºC em tubos de ensaio

Figura 4 – Manutenção de células viáveis a -20 ºC em tubos do tipo Eppendorf

3.3. IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Serratia

s bactérias foram identificadas em nível de espécie com base nas características morfológicas e fisiológicas segundo a metodologia descrita em Holt et al. (1994) e utilizando-se o Kit API 20E fabricado pela Biomériux que se fundamenta em 21 testes bioquímicos em 20 microtubos que contêm os substratos desidratados.

3.4. PRODUÇÃO DE PIGMENTO PELOS 12 ISOLADOS DE Serratia marcescens EM MEIO SÓLIDO

análise qualitativa referente à produção de pigmento por S. marcescens foi realizado em Agar Nutritivo (Apêndice: A), a 28 ºC, sob luminosidade, em estado estacionário, por 24 horas. Após o período de incubação a presença de pigmento foi observada macroscopicamente.

3.5. SELEÇÃO DA ESPÉCIE PRODUTORA DE MAIOR QUANTITATIVO DE PIGMENTO

s bactérias identificadas no item 3.3 foram submetidas a fermentação submersa para selecionar uma espécie produtora de maior quantitativo de pigmento. Para se fazer essa seleção foram realizados os seguinte procedimentos a seguir:

3.5.1. FERMENTAÇÃO SUBMERSA: PRODUÇÃO DE PIGMENTOS

as culturas obtidas no item 3.2 foi retirado alíquota para obtenção de uma suspensão celular semelhante à coluna 1,0 da escala de Mac Farland. Dessa suspensão retirou-se uma alíquota (2 x 106 células/mL meio) para 10 mL de Caldo Nutritivo (Apêndice: B) em Erlenmeyer 50 mL. Esse pré-cultivo foi mantido a 28 ºC, a 300 rpm. Após 12 horas o pré-cultivo foi transferido para 50 mL de meio contido em Erlenmeyer de 250 mL. A fermentação foi realizada em condições idênticas ao précultivo, em triplicata (BERMÚDEZ et al., 2004).

3.5.2. QUANTIFICAÇÃO DO PIGMENTO PRODUZIDO POR Serratia ara a quantificação do pigmento “prodigiosina” presente nas amostras (extrato bruto) foi determinado o valor da absorbância a dois comprimentos de onda diferentes: 1) a 534 nm, que corresponde ao pico de absorção da prodigiosina e, 2) a 655 nm para a correção da interferência das substâncias presentes na amostra, uma diferença de valor 1,0 entre os dois valores de absorbância equivale a 19,3 μg de prodigiosina por mililitro (RAMONEDA, 2000). A quantificação de pigmento foi realizada seguindo-se as recomendações de Goldschmidt e Williams (1968), conforme descrito a seguir:

Equação 1 – Cálculo para determinação da produção de prodigiosina por mL de Caldo Nutritivo

3.6. CRESCIMENTO DA ESPÉCIE DE Serratia SELECIONADA RELACIONADO À PRODUÇÃO DE PIGMENTO

ara se analisar o crescimento versos a produção de pigmento, a espécie de Serratia selecionada foi submetida à fermentação submersa em caldo nutritivo (Apêndice: B). Da cultura estoque item 3.2 foi retirado alíquota para obtenção de uma suspensão celular semelhante à coluna 1,0 da escala de Mac Farland. Dessa suspensão retirou-se uma alíquota (2 x 106 células/mL meio) para 25 mL de meio líquido em Erlenmeyer 125 mL. Os 25 cultivos foram mantidos a 28 ºC, a 300 rpm. A cada 60 minutos, durante 24 horas, retirou-se uma amostra para determinação do crescimento a 610 nm (KOCH, 1994) e quantificação do pigmento segundo Goldschmidt e Williams (1968).

3.7. DETECÇÃO DE FATORES DE PATOGENICIDADE DA ESPÉCIE SELECIONADA

ara se identificar o potencial da espécie selecionada como microrganismo de interesse industrial determinou-se os seguintes fatores de patogenicidade:

Atividade de fosfolipase: A produção de fosfolipase foi verificada pela metodologia sugerida por Price et al. (1982) e Oliveira et al. (1998). Onde colônias com crescimento de 24 horas a 37ºC em ágar nutritivo foram inoculadas em um ponto na placa de ágar fosfolipase (Apêndice: C) com emulsão de ovo a 50% em solução fisiológica. A leitura

do teste foi realizada após 2 dias de incubação a 37 ºC, sendo considerado como positivo a produção de zona opaca de precipitação ao redor da colônia. A atividade enzimática (Pz) foi medida através da razão entre o diâmetro da colônia e o diâmetro da colônia mais a zona de precipitação. Quanto menor o valor de Pz, maior a atividade enzimática, sendo os resultados apresentados Pz = 1,0 (ausência de atividade enzimática), Pz entre 0,64 e 1,0 (atividade enzimática positiva) e o Pz ≤ 0,63 (atividade enzimática fortemente positiva). Hemólise em ágar sangue: A grande maioria de bactérias patogênicas provocam lise completa de hemácias (hemólise). Este fenômeno foi identificado em meio ágar sangue (Apêndice: D) como uma zona clara ao redor das colônias. Em alguns casos ocorre um tipo de lise incompleta, na qual as células vermelhas retraem-se e tornamse esverdeadas (ocorre somente na presença de oxigênio devido à redução da hemoglobina) sendo denominada hemólise tipo alfa (α-hemólise). Quando a se verifica a lise completa das células vermelhas denomina-se hemólise tipo beta (β-hemólise) e os microrganismos que não provocam lise ou não redução da hemoglobina são denominados anemolíticos ou hemólise tipo gama (γ-hemólise) (BIER,1985; MURRAY, 2000; TRABULSI, 2002). Atividade de Protease: A produção de protease também foi verificada segundo Oliveira et al. (1998). O fenômeno foi observado a partir do cultivo da amostra por 24 horas a 37 ºC em ágar nutritivo (Apêndice: A) inoculada em pontos eqüidistantes em placas de ágar protease (Apêndice: F). As placas foram incubadas durante dois dias a 37 ºC e a leitura da atividade enzimática (Pz) foi realizada usando-se o mesmo esquema da atividade para fosfolipase. Características fisiológicas (crescimento a 37 ºC): Um grande número de bactérias apresenta crescimento ótimo em temperaturas variando entre 25 e 40 ºC (Mesófilas), ou seja, uma faixa de temperatura comum nos organismos animais. A maioria dos patógenos humanos apresenta crescimento ótimo em temperaturas próximas de 37 °C (BIER, 1985). Para observação do crescimento a 37 ºC, a bactéria selecionada foi semeada por esgotamento em ágar nutritivo (Apêndice: A) contido em placa de Petri, conforme a formulação citada a seguir (BIER, 1985; HOLT et al., 1994). As culturas, em triplicata, foram mantidas a 37 ºC, por 24 horas. Após o período de incubação a positividade se da pela presença de colônias bacterianas.

3.8. ANÁLISE PARA IDENTIFICAÇÃO DOS FATORES QUE INFLUENCIAM NA PRODUÇÃO DE PIGMENTO

ara identificação da influência da idade do inóculo, temperatura, pH do meio de fermentação e agitação na produção de pigmentos da espécie selecionada foram realizadas as análises detalhadas a seguir:

3.8.1. DETERMINAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA IDADE DO INÓCULO

idade do inóculo foi determinada a partir de culturas obtidas em ágar nutritivo (Apêndice: A) por 12 horas e 24 horas a 28 ºC. Nessas culturas foi preparada uma suspensão de células e os experimentos foram realizados, em triplicata, como citado no item 3.5.2.

3.8.2. EFEITO DA TEMPERATURA, pH E AGITAÇÃO

efeito do pH, temperatura e agitação na produção de pigmento pela espécie selecionada foi avaliado utilizando-se a idade do inóculo selecionado no item 3.8.1, pH 8,0 e 9,0. Os cultivos foram mantidos a 150 e 300 rpm nas seguintes temperaturas: 25, 30, 35 e 37 ºC. A produção de pigmento foi determinada como citado no item 2.5.2 (MEJÍA-SAULÉS et al., 2006).

3.8.3. SELEÇÃO DO MEIO DE PRODUÇÃO DO PIGMENTO

s meios selecionados para analisar a produção de pigmento pela espécie selecionada foram: extrato de malte 5% (p/v) (Apêndice: H), caldo nutritivo (Apêndice: A) e água peptonada 2% (p/v) (Apêndice: G) (BIER, 1985; GIRI et al., 2004). Os meios de cultivos foram preparados e mantidos nas condições identificadas no item 3.5.2 (NAMPOOTHIRI; PANDEY, 1995).

3.9. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA (MÉTODO DO BLOCO DE GELOSE)

atividade antimicrobiana foi realizada em meio sólido, pelo método do bloco de gelose (LARPENT; SANGLIER, 1989; MATSUURA, 1998). A cultura estoque de cada microrganismo-teste foi obtida em ágar nutritivo, a 28 ºC por 24 horas. A partir dessas culturas foi preparada uma suspensão celular em caldo Müeller-Hinton (Apêndice: I) com densidade semelhante à coluna 0,5 da escala de Mac Farland. Dessa suspensão, as células foram retiradas com um swab estéril e posteriormente inoculado em ágar Müeller-Hinton (Apêndice: E), em estria, formando uma camada uniforme. Da cultura de S. marcescens selecionada com 24 horas de crescimento, a 28 ºC foram retirados três fragmentos em forma circular (plug), com auxilio de um furador com diâmetro igual a 10 mm. Esses plugs foram superpostos na superfície dos cultivos dos microrganismos teste, em meio sólido, seguindo-se a incubação a 37 ºC por 24 horas. A atividade antimicrobiana foi determinada em milímetro, medindo-se o diâmetro do halo pelo reverso da placa de Petri. Os microrganismos-teste analisados contra S. marcescens selecionada estão relacionados na tabela 3.

Tabela 3 – Microrganismos-teste analisados contra S. marcescens

3.10. EXTRAÇÃO DO PIGMENTO (DICLOROMETANO)

btenção Extrato: A fermentação foi realizada com caldo nutritivo a 28 ºC por 18 h, a 300 rpm. A extração do pigmento com diclorometano foi realizada na proporção de 1:1 (v/v), sendo 100 mL de meio de cultura e 100 mL de diclorometano em um Erlenmeyer de 500 mL, mantendo-se o preparado sobre agitação (150 rpm) a 28 ºC por 1 h. (RAMONEDA, 2000). A fração diclorometano foi obtida em funil de separação e armazenado em tubos com rosca de 25 x 200 mm (Figura 5).

Figura 5 - Extrato da fermentação obtido com diclorometano

O extrato foi submetido à análise cromatográfica em camada delgada e a espectroscopia na região do infravermelho.

3.10.1. ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DA FRAÇÃO DICLOROMETANO

extrato obtido no item 3.10 foi aplicado em uma cromatoplaca de sílica gel com auxílio de um capilar de vidro, a uma distância de aproximadamente 1cm de cada amostra. Cada cromatoplaca foi acondicionada em uma cuba cromatográfica, contendo a fase móvel hexano/acetato de etila/metanol (3:4:3 v/v/v). Após a evaporação dos solventes em capela de exaustão, as placas foram examinadas com luz branca e luz ultravioleta de 365 nm, determinando-se os valores de Rf. (RAMONEDA, 2000).

3.10.2. ANÁLISE DE ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO DA FRAÇÃO DICLOROMETANO

análise na região do infravermelho foi realizada na central analítica da Universidade Federal do Amazonas – UFAM, no espectro Per Kim Elmer modelo FT-IR Spectrometer/Spectrum 2000. As alíquotas do extrato do fermentado de Serratia marcescens FS3 foram injetadas nas seguintes condições: em um cadinho de quartzo pulverizado de KBr adiciona-se 0,2 mg da amostra, com o auxílio de uma prensa manual confeccionou-se pastilhas contendo KBr com a amostra e outra apenas com o KBr para calibrar o equipamento (branco) para posterior análise (SILVA et al., 2006).

3.11. ANÁLISE ESTATÍSTICA

s dados referentes a produção de pigmento foram submetidos à Analise de Variância (ANOVA e testes não paramétrico (Kruskal-Wallis)) para verificar a variação intra e intervariáveis, utilizando-se os programas MINITAB 12,1, 1998 e Microsoft Office Excel, 2003.

CAPÍTULO 4 CAPÍTULO 4

4. RESULTADOS 4.1. IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Serratia

s resultado referentes a identificação, em nível de espécie, das 12 amostras de Serratia comprovoram que 100% são S. marcescens (Figura 6). Serratia fazem parte da Família Enterobacteriaceae, se diferencia dos demais membros pela produção de pigmento vermelho. As diferentes espécies podem ser isoladas de qualquer amostra biológica, inclusive de amostras clínicas (GIRI et al., 2004; MENEZES et al., 2004). Nos estudos realizados por Menezes et al (2004) quando verificaram a frequência das espécies de Serratia em 1197 amostras de urina de pacientes internados em um hospital de referência da Região Nordeste, esses autores confirmaram a presença S. liquefaciens (46,6%), S. odorifera (33,4%) e S. rubidaea (20,0%), como as mais frequentes. Embora, S. marcescens esteja associada a uma variedade de infecções humanas e citada como patógeno predominante, essa espécie não foi isolada das amostras de urina analisadas. Linhagens de Serratia que não produzem pigmento são clinicamente de maior significância.

Figura 6 - Característica de S. marcescens corada pelo Método de Gram (bastonetes Gramnegativos)

4.2. DETECÇÃO DA PRODUÇÃO DE PIGMENTO POR ISOLADOS DE Serratia marcescens EM MEIO SÓLIDO

s pigmentos de origem bacteriana, assim como as enzimas e antibióticos são metabólitos secundários de importância à humanidade pela aplicação, entre outras, na área médica e alimentícia (GIRI et al, 2004).

Entre os diferentes isolados de S. marcescens analisados quanto a produção de pigmento em meio sólido (ágar nutritivo), 100% das bactérias exibiram pigmentação vermelha. O pigmento vermelho produzido por S. marcescens e Streptomyces, entre outras bactérias, denomina-se prodigiosina, grupo de produto natural com estrutura tipo tripirrol linear, com peso de 323,44 dalton (fórmula molecular C20H25N3O). Esse pigmento não é difusível (Figura 7), tem sensibilidade à luz e insolúvel em água (GIRI et al, 2004; MANDERVILLE, 2001; RAMONEDA, 2000). Na década de 60, prodigiosina foi estudada como agente antimalárico e citotóxico, época em que ficou comprovada a atividade tóxica desse microrganismo. Entretanto,

na década passada esse pigmento demonstrou potencial imunossupressivo (GIRI et al., 2004; MANDERVILLE, 2001).

atividade

como

Figura 7 - Cultura de S. marcescens obtida em 24 h, a 37 ºC, em ágar nutritivo, apresentando pigmento não difusível

4.3. SELEÇÃO DA ESPÉCIE DE Serratia PRODUTORA DE MAIOR QUANTITATIVO DE PIGMENTO

s resultados referentes à produção de pigmento pelas 12 amostras de S. marcescens por fermentação submersa estão relacionados na tabela 3. Os dados obtidos mostraram que todas as espécies de Serratia produziram pigmento vermelho (Figura 8). Entre os diferentes isolados de S. marcescens analisados quanto a produção de pigmento em meio sólido (ágar nutritivo), 100% das bactérias exibiram pigmentação vermelha. A análise de variância não demonstrou diferença significativa (p>0,05) entre as médias dos valores de pigmento produzido por essas bactérias. Entretanto, S. marcescens FS3 foi a que expressou os maiores valores de pigmento (8,493 µg/mL) no meio de fermentação (caldo nutritivo) (Tabela 3).

Figura 8 - Pigmento vermelho produzido por S. marcescens em caldo nutritivo, por fermentação submersa, a 28 ºC, 300 rpm por 24 horas

Tabela 4 – Concentração de prodigiosina produzido por 12 isolados de S. marcescens em caldo nutritivo, a 28 ºC por 24 horas, a 300 rpm

Os resultados obtidos neste estudo estão em consonância com os realizados por Giri et al. (2004), que obteve também a produção de prodigiosina por S. marcescens em caldo nutritivo. Estatisticamente, comprovou-se que há diferença significativa (p<0,05) entre as médias dos valores desse biocomposto nos 12 isolados analisados. Observou-se ainda que o comportamento fisiológico é diferenciado quanto à produção de prodigiosina entre os isolados de S. marcescens. De acordo com Kobayashi; Ichikawa (1991), a produção de pigmento é altamente variável entre espécies e depende de vários fatores, como o tempo de incubação do microrganismo. Ramoneda (2000) afirma que os biótipos de S. marcescens que produzem prodigiosina sintetizam enzimas responsáveis pela condensação dos precursores desse pigmento enquanto as que não produzem comumente são deficientes desses biocatalizadores. Outros fatores que influenciam na produção de biopigmento são os físico-químicos e as condições de fermentação.

4.4. CARACTERIZAÇÃO DE S. marcescens FS3 4.4.1. DETECÇÃO DE FATORES DE PATOGENICIDADE

s resultados das análises realizadas para se detectar os fatores de patogenicidade de S. marcescens FS3 estão mostrados na tabela 4. De acordo com dados obtidos, a espécie selecionada apresentou crescimento a 37 ºC, hemólise em ágar sangue negativa, atividade positiva protease, mas não expressou atividade de fosfolipase e urease. Além dos fatores analisados, Murray et al. (1998) descreve como fatores de virulência das bactérias, produção de adesinas, invasinas, toxinas e presença de cápsula. Tratando-se de S. marcescens FS3, há necessidade da realização de análises complementares para classificação quanto aos fatores de virulência. Tanaka et al. (2004) cita que outrora S. marcescens era considerada como não patogênica em humanos, mas na atualidade tem grande significância devido causar infecções nosocomiais.

Tabela 5 – Características de S. marcescens FS3 relacionadas aos fatores de patogenicidade

4.4.2. CRESCIMENTO DE S. marcescens FS3 RELACIONADO A PRODUÇÃO DE PIGMENTO

crescimento de S. marcescens FS3 e a produção de pigmento no período de 24 horas estão apresentados no gráfico 1. S. marcescens FS3 não apresentou crescimento típico bacteriano, contudo expressou fase de adaptação, exponencial e estacionária, no período entre 1 a 16 horas de fermentação. A presença da fase de adaptação indica que houve necessidade de ressíntese de biocompostos para a bactéria iniciar o crescimento (MADIGAN et al., 2000; CRUEGER; CRUEGER, 1990). A partir de 17 horas, verificou-se a fase exponencial e a fase estacionária, não se observando fase de declínio. Essa última forma de crescimento se denomina de crescimento do tipo diaúxico. Este tipo de crescimento ocorre quando há repressão catabólica devido à presença de duas fontes de carbono no meio. Então, o organismo utiliza primeiro uma fonte de energia e quando há exaustão dessa fonte, ocorre a interrupção do crescimento, em seguida o microrganismo continua o crescimento, mas consumindo da outra fonte de energia (MADIGAN et al., 2000). Os dados do gráfico 1 mostram que S. marcescens iniciou a produção de pigmento (0,039 μg/mL) a partir de sete horas, atingindo a produção máxima (5,84 μg/mL) de pigmento as 18 e 19 horas de crescimento em meio líquido. Nessa condição de fermentação a produção de pigmento não aumentou na proporção do crescimento celular. Nos estudos realizados por Kim et al. (1999), o tempo de produção máxima de pigmento foi semelhante ao apresentado no gráfico 1, embora o quantitativo de pigmento (5,41g/L) tenha sido superior quando o substrato utilizado foi caseína.

Gráfico 1 – Crescimento de S. marcescens relacionado à produção de pigmento em 50 mL de caldo nutritivo por 28 ºC, 300 rpm

4.5. ANÁLISE PARA IDENTIFICAÇÃO DOS FATORES QUE INFLUENCIAM NA PRODUÇÃO DE PIGMENTO 4.5.1. DETERMINAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA IDADE DO INÓCULO

ara aumentar a produção de pigmento durante o processo de fermentação, vários fatores que tem grande influência na produção desses bioprodutos devem ser analisados, entre os quais podemos citar: a composição do meio de cultura utilizado, a temperatura de crescimento do microrganismo, o pH e a aeração do meio assim como a idade do inóculo (PAPAGIANNI; MOO-YOUNG, 2002). Os resultados referentes à influência da idade do inoculo (Gráfico 2) na produção de pigmento comprovaram que, as culturas com 12 horas de crescimento proporcionaram a obtenção de quantitativo de pigmento correspondente a 6,884 μg/mL de meio de cultura. Quando culturas de S. marcescens foram submetidas a fermentação utilizando-se inóculo com 24 horas de crescimento o quantitativo de pigmento (8,106 μg/mL) foi superior 15,07%. Esses dados confirmam que as culturas com 24 horas de idade são mais produtoras do pigmento.

Gráfico 2 – Produção de pigmento em µg/mL relacionado à idade do inoculo (12h e 24h) em caldo nutritivo

4.5.2. EFEITO DA TEMPERATURA, pH E AGITAÇÃO NA PRODUÇÃO DE PIGMENTO

tabela 5 está demonstrando o resultado da produção de pigmento por S. marcescens em diferentes condições agitação, pH e temperatura de crescimento. Os parâmetros de fermentação estão associados com produção de pigmento. O pH do meio de fermentação e a temperatura de incubação foram parâmetros que influenciaram na produção de pigmento por S. marcescens FS3.

Tabela 6 – Parâmetros que influenciaram na produção de prodigiosina em diferentes condições de fermentação: agitação, pH e temperatura, 24 horas de incubação

As melhores condições de fermentação foram 28 ºC, pH 7 e 300 rpm, nessas condições a produção de pigmento obtida foi máxima (8,493 μg/mL de meio). Outra condição de fermentação que favoreceu a produção de pigmento (5,919 μg/mL e 6,697 μg/mL) por Serratia marcescens foi pH 8 e 9 (30 ºC; 300 rpm) (Gráfico 2). Com estes resultados pode-se inferir que tanto a temperatura quanto o pH afetam positivamente na maior produção de pigmento e a melhor condição de agitação foi 300 rpm que pode ser explicado pela maior aeração do processo fermentativo (RAMONEDA, 2000) (Tabela 5).

Gráfico 3 – Parâmetros que proporcionaram a produção de maior quantitativo de pigmento por S. marcescens (agitação de 300 rpm; pH 7, 8 e 9; temperatura de 28 ºC e 30 ºC)

Com relação a esses resultados, as análises estatísticas (p<0,05) revelaram que houve diferença entre as médias referentes a concentração de pigmento produzido por Serratia marcescens FS3.

4.5.3. SELEÇÃO DO MEIO DE PRODUÇÃO DO PIGMENTO

ntre os meios de cultura analisados (Tabela 6), S. marcencens produziu, em média, o maior quantitativo (7,945 µg/mL de meio) de pigmento em caldo nutritivo. Comparando-se o quantitativo de pigmento nos diferentes meios de cultura (água peptonada 2%, extrato de malte 5% e caldo nutritivo), comprovou-se que em caldo nutritivo e água peptona foram obtidos os maiores níveis de pigmento, em caldo nutritivo foi 32,80% superior ao obtido em água peptonada. Os resultados das análises estatísticas, considerando-se p<0,05, confirmam que houve diferença significativa entre as médias referentes ao quantitativo de pigmento.

Tabela 7 – Quantitativo de pigmento produzido por S. marcescens FS3 em diferentes meios de cultura, a 28 ºC, pH 7, a 300 rpm. 24 horas de incubação

4.6. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE S. marcescens FS3 CONTRA BACTÉRIAS E LEVEDURA DE IMPORTÂNCIA MÉDICA

e acordo com os dados da tabela 6, observa-se que a bactéria S. marcescens FS3 mostrou a maior atividade antimicrobiana contra bactérias, principalmente contra Escherichia coli e Mycobacterium smegmatis conforme pode ser observado na tabela 6.

Tabela 8 – Halo de inibição apresentado pelo antagonismo entre Serratia marcescens FS3 frente os microrganismos-teste pelo método do Bloco de Gelose

Apesar de Someya et al. (2004) citar que a prodigiosina purificada mostra atividade antifúngica, os dados da tabela 7 corroboram, em parte, com estes resultados, pois encontramos atividade antibacteriana e antifúngica, mas a partir do microrganismo crescido em ágar (Figura 9).

Figura 9 – Atividade antimicrobiana de S. marcescens contra (A) Escherichia coli, (B) Staphylococcus aureus, (C) Candida albicans, (D) Mycobacterium smegmatis

4.7. ANÁLISE EM CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA E ESPECTROMETRIA DE INFRAVERMELHO 4.7.1. ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DO EXTRATO DA FRAÇÃO DICLOROMETANO

cromatografia em camada delgada (CCD) é um método essencial para uma rápida análise de metabólitos de origem microbiana, como antibióticos, pigmentos, ácidos entre outros, uma vez que, possibilita a análise de um número considerável de amostras simultaneamente (ZELENKOVA et al., 2003).

A análise por cromatografia em camada delgada (hexano/acetato de etila/metanol 3:4:3 v/v/v) apresentou um spot de coloração roxo quando exposta a luz branca, apresentando Rf= 0,6 e quando exposto a luz ultra violeta de 365 nm apresentou três “spots” com Rf’s de 0,5; 0,6 e 0,7.

4.7.2. ANÁLISE DE ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO DA FRAÇÃO DICLOROMETANO

espectro na região do infravermelho do extrato apresentou absorções em 2924 e 2856 cm-1 referente a estiramento de C-H, 1677 cm-1 e 1649 cm-1 referente a sistema C=C, além da absorção em 3395 cm-1 atribuída a N-H (Figura 10).

Figura 10 – Espectroscopia na região do infravermelho da fração diclorometano

Wasserman; Vu (1990) descreve a prodigiosina como um antibiótico natural da família dos alcaloides. No espectro expresso na figura 10 observou-se sinais característicos dos sistemas alcaloides para tanto podemos sugerir a presença de prodigiosina. Havendo necessidades de investigação do tipo RMN1H para a confirmação da presença da prodigiosina.

CAPÍTULO 5 CAPÍTULO 5

5. CONCLUSÕES As amostras de Serratia analisadas são produtoras de pigmento de coloração vermelha e todas são Serratia marcescens; O isolado que expressou os maiores valores de pigmento foi S. marcescens FS3, comprovando-se para essa espécie que: a) As melhores condições de fermentação para a produção de pigmento são: inóculo com idade de 24 horas; caldo nutritivo pH 7,0; temperatura de 28 ºC; a 300 rpm; b) No meio de fermentação, a produção de pigmento não apresenta-se associado ao aumento de biomassa; c) A atividade antibiose foi positiva contra bactérias e leveduras, com destaque contra Escherichia coli e Mycobacterium smegmatis; d) Através de análise cromatográfica (cromatografia em camada delgada), detectou-se na luz branca a presença de biocompostos distintos constituindo o pigmento vermelho com Rf=6 e quando exposto a luz ultravioleta de 365 nm apresentou três “spots” com Rf’s de 0,5; 0,6 e 0,7; e) Na espectroscopia na região do infravermelho observou-se sinais característicos dos sistemas alcaloides, sugerindo a presença de substâncias tipo prodigiosina.

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APÊNDICE APÊNDICE MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS: (A) Ágar Nutritivo Extrato de carne Peptona bacteriológica Ágar bacteriológico Água destilada pH

...................................................... ...................................................... ...................................................... ...................................................... ......................................................

3,0 g 5,0 g 15,0 g 1000,0mL 7,0

(B) Caldo Nutritivo Extrato de carne Peptona bacteriológica Água destilada pH

3,0 g 5,0 g 1000,0mL 7,0

(C) Ágar Fosfolipase Peptona bacteriológica Glicose Cloreto de sódio Cloreto de cálcio Ágar bacteriológico Água destilada pH

10,0 g 30,0 g 57,3 g 0,5 g 20,0 g 1000,0mL 7,0

(D) Ágar Sangue Ágar Müeller-Hinton fundido ...................................................... 100,0 mL Sangue de Coelho ...................................................... 5,0 mL pH ...................................................... 7,0 (E) Ágar Müeller-Hinton Extrato de carne Peptona caseína Amido solúvel Ágar Ágar Água destilada q.s.p. pH

2,0 g 17,5 g 1,5 g 15,0 g 1000,0mL 7,0

(F) Ágar Protease Ágar base fonte de carbono para levedura Albumina bovina fração V Protovit Água destilada Ágar bacteriológico Água destilada

...................................................... 11,7 g ...................................................... ...................................................... ...................................................... ...................................................... ......................................................

2,0 mL 2,5 g 100,0 mL 15,0 g 900,0 mL

(G) Água Peptonada Peptona de carne ...................................................... 20,0 g Água destilada ...................................................... 1000,0mL

(H) Caldo Extrato de Malte Extrato de malte ...................................................... 50,0 g Água destilada ...................................................... 1000,0mL (I) Caldo Müeller-Hinton Extrato de carne Peptona caseína Amido solúvel Água destilada q.s.p. pH

2,0 g 17,5 g 1,5 g 1000,0mL 7,0

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE PIGMENTOS PRODUZIDOS POR BACTÉRIAS DO GÊNERO Serratia ISOLADAS DE SUBSTRATOS AMAZÔNICOS Raimundo Felipe da Cruz Filho & Maria Francisca Simas Teixeira RESUMO Existem diversos pigmentos naturais, principalmente de origem vegetal (flores, frutos, folhas e raízes), mas poucos estão disponíveis para aproveitamento industrial, pois são de difícil extração, custo elevado no processo de extração ou toxicidade considerável para o homem ou meio ambiente. A atual tendência por produtos naturais promove o interesse em explorar novas fontes para a produção biotecnológica de pigmentos para aplicação na indústria. Este trabalho teve como objetivo a identificação de espécies de Serratia, e entre estas, selecionar uma produtora de maior quantitativo de pigmentos de importância para a indústria alimentícia e farmacêutica. Foram analisados 12 isolados de bactérias de coloração vermelha, com características do gênero Serratia. As culturas foram identificadas como Serratia marcescens utilizando-se o Kit API 20E (BioMérieux). Entre os diferentes isolados de S. marcescens analisados, 100% das bactérias exibiram pigmentação vermelha, em Agar Nutritivo. A idade do inóculo que proporcionou obtenção de maior produção de pigmento foi o de 24 horas de crescimento com 8,106 μg/mL. As melhores condições de fermentação foram 28 ºC, pH 7 e 300 rpm, quando a produção máxima de pigmento obtida foi 8,493 μg/mL de meio (Caldo Nutritivo). Entre os meios de cultura analisados, S. marcencens FS3 produziu, em média, o maior quantitativo de pigmento em Caldo Nutritivo (7,945 μg/mL). A análise do fermentado de S. marcencens FS3 através de cromatografia em camada delgada, utilizando-se como fase móvel hexano/acetato de etila/metanol 3:4:3 (v/v/v) apresentou uma única mancha de coloração roxa quando exposta a luz branca, apresentando Rf de 0,6 e quando exposto a luz ultravioleta com comprimento de onda de 365 nm apresentou três bandas com valores de Rf de 0,5; 0,6 e 0,7. No espectro de infravermelho observou-se características de alcaloides, que sugerem a presença da prodigiosina. Os resultados mostram a necessidade da realização de investigação do tipo RMN-1H e outras análises para a confirmação da presença de prodigiosina.

CRUZ FILHO, R.F. da; TEIXEIRA, Maria Francisca Simas. Avaliação do potencial biotecnológico de pigmentos produzidos por bactérias do gênero Serratia isoladas de substratos amazônicos. 1ª edição: Duque de Caxias: Espaço Científico Livre Projetos Editoriais, 2013.