Η ΑΣΘΕΝΕΙΑ ΤΟΥ ΚΙΤΡΙΝΟΥ ΚΑΡΟΥΛΙΑΣΜΑΤΟΣ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ ΤΟΜΑΤΑΣ ΚΑΙ Ο ΑΛΕΥΡΩ∆ΗΣ (Bemisia tabaci Gennadius) ΦΟΡΕΑΣ ΤΗΣ Λάµπρος Χρ. Παπαγιάννη
ΙΝΣTITOYTO ΓEΩPΓIKΩN EPEYNΩN YΠOYPΓEIO ΓEΩPΓIAΣ ΦYΣIKΩN ΠOPΩN KAI ΠEPIBAΛΛONTOΣ
ISSN 1986-1370
Υπεύθυνος έκδοσης ∆ρ Μ.Κ. Κυριάκου
Επιµέλεια έκδοσης Ξένια Ευριπίδου
Για τις πληροφορίες που περιέχονται στην παρούσα έκδοση, την αποκλειστική ευθύνη φέρουν οι συγγραφείς. Τυχόν χρησιµοποίηση εµπορικών ονοµάτων δεν σηµαίνει ότι το Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών υποστηρίζει συγκεκριµένα προϊόντα ούτε αποτελεί διάκριση κατά οποιωνδήποτε προϊόντων.
Η ΑΣΘΕΝΕΙΑ ΤΟΥ ΚΙΤΡΙΝΟΥ ΚΑΡΟΥΛΙΑΣΜΑΤΟΣ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ ΤΟΜΑΤΑΣ ΚΑΙ Ο ΑΛΕΥΡΩ∆ΗΣ (Bemisia tabaci Gennadius) ΦΟΡΕΑΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΛΗΨΗ
Η ασθένεια του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας αποτελεί µια από τις σηµαντικότερες ιολογικές ασθένειες στις καλλιέργειες τοµάτας διεθνώς. Τουλάχιστον 11 ιοί, που κατατάσσονται στο γένος Begomovirus της οικογένειας Geminiviridae των φυτικών ιών, έχουν αναφερθεί να προκαλούν την ασθένεια σε παγκόσµιο επίπεδο. Οι ιοί αυτοί παρουσιάζουν εκτεταµένο εύρος ξενιστών και εκτός από την τοµάτα προσβάλλουν αρκετά άλλα είδη καλλιεργούµενων και αυτοφυών φυτών. Στην περιοχή της ανατολικής Μεσογειακής λεκάνης, µέχρι στιγµής αναφέρονται δύο ιοί του γένους: ο ιός του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) που περιλαµβάνει τέσσερα στελέχη (φυλές) και ο ιός του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας της Σαρδηνίας (Tomato yellow leaf curl Sardinia virus, TYLCSV) που περιλαµβάνει τρία στελέχη. Όλοι οι ιοί µεταδίδονται αποκλειστικά µε τον αλευρώδη του καπνού (Bemisia tabaci Gennadius). Στην Κύπρο, η ασθένεια εντοπίστηκε για πρώτη φορά το 1974 και έκτοτε αποτελεί την πιο διαδεδοµένη ιολογική ασθένεια στις υπαίθριες και τις θερµοκηπιακές καλλιέργειες τοµάτας. Στα πλαίσια των δραστηριοτήτων του Ινστιτούτου Γεωργικών Ερευνών (ΙΓΕ), διερευνήθηκε µε τη χρήση καινοτόµων µοριακών τεχνικών η παρουσία των ιών που σχετίζονται µε την ασθένεια, καθώς και των βιοτύπων του φυσικού φορέα B. tabaci. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι στην Κύπρο εντοπίζεται αποκλειστικά ο ιός TYLCV που µεταδίδεται µε τους βιότυπους B και Q του αλευρώδη B. tabaci. Επιπλέον, ο ιός εντοπίστηκε σε καλλιέργειες φασολιάς και πιπεριάς, καθώς και σε 49 είδη ζιζανίων που ανήκουν σε 15 βοτανικές οικογένειες. Ο µοριακός χαρακτηρισµός των αποµονώσεων του ιού κατέδειξε ότι στην Κύπρο εντοπίζεται τόσο το Ισραηλινό (IL), όσο και το ήπιο (MLD) στέλεχος, που παρουσιάζουν υψηλή οµοιότητα µε αντίστοιχες αποµονώσεις από τη Μέση Ανατολή. Τέλος, η φυλογενετική ανάλυση µέρους του µιτοχονδριακού DNA των αλευρωδών που µελετήθηκαν, κατατάσσει τους κυπριακούς πληθυσµούς στο βόρειο αφρικανικό-µεσογειακό-µεσανατολικό κλάδο του συµπλέγµατος του αλευρώδη του καπνού. 3
ΠΑΘΟΓΟΝΑ ΑΙΤΙΑ, ΞΕΝΙΣΤΕΣ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΑΣΘΕΝΕΙΑΣ ΤΟΥ ΚΙΤΡΙΝΟΥ ΚΑΡΟΥΛΙΑΣΜΑΤΟΣ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ ΤΟΜΑΤΑΣ Ιστορικά στοιχεία Τα πρώτα στοιχεία για την ασθένεια καταγράφηκαν περί τα τέλη της δεκαετίας του 1930 στο Ισραήλ, όταν σε µεµονωµένες καλλιέργειες τοµάτας εµφανίστηκαν συµπτώµατα µικροφυλλίας, κιτρινίσµατος και συστροφής σε φύλλα, καθώς και έντονος νανισµός των φυτών (Avidon, 1944), χωρίς ωστόσο να προκληθούν σηµαντικές απώλειες στην παραγωγή. Η ασθένεια επανεµφανίστηκε σχεδόν µετά από τριάντα χρόνια, όταν στα πλαίσια µιας προσπάθειας για αναδιάρθρωση της καλλιέργειας τοµάτας από τις αρχές της χώρας, το Υπουργείο Γεωργίας του Ισραήλ παρότρυνε τους παραγωγούς να αντικαταστήσουν την παραδοσιακή ποικιλία Marmande µε την ποικιλία Moneymaker, η οποία θεωρείτο καταλληλότερη για τις εξαγωγές, αφού ο καρπός της µπορούσε να διατηρηθεί για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα. Μόλις ένα µήνα µετά τη φύτευση, τα περισσότερα φυτά παρουσίασαν περίεργα συµπτώµατα που περιελάµβαναν σοβαρό νανισµό, κίτρινο µεταχρωµατισµό, καρούλιασµα και παραµόρφωση των φύλλων, ενώ η παραγωγή ήταν ελάχιστη και οι καρποί δεν ήταν πλέον εµπορεύσιµοι. Τα συµπτώµατα είχαν αποδοθεί σε µια άγνωστης φύσης ασθένεια και συσχετίστηκαν µε τους υψηλούς πληθυσµούς εντόµων της οικογένειας των αλευρωδών, οι οποίοι είχαν αναπτυχθεί σε γειτονικές καλλιέργειες βαµβακιού. Κατά τη διερεύνηση του προβλήµατος διαπιστώθηκε πως η ασθένεια µεταδιδόταν µε τους αλευρώδεις και µπορούσε να προσβάλει τόσο τις τοµάτες της ποικιλίας Marmande, όσο και εκείνες της ποικιλίας Moneymaker (Cohen and Nitzani, 1960). Το παθογόνο αίτιο της ασθένειας περιγράφηκε το 1963 και η ασθένεια αποδόθηκε στον ιό του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) (Cohen et al., 1963), o οποίος µεταδιδόταν µε τον αλευρώδη του καπνού Bemisia tabaci (Gennadius) (Cohen and Nitzany, 1966). Η πρώτη παρατήρηση της µορφής των ιοσωµατίων έγινε το 1980 (Russo et al., 1980), και ο ιός αποµονώθηκε το 1988 (Czosnek et al., 1988). Τρία χρόνια αργότερα, προσδιορίστηκε η πλήρης νουκλεοτιδιακή αλληλουχία του γονιδιώµατος του και τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι ο ιός αποτελείτο από DNA απλής αλυσίδας (ssDNA) (Navot et al., 1991). Η ευρεία διάδοση της ασθένειας σε πολλές γεωγραφικές περιοχές του πλανήτη, σε συνδυασµό µε τη συσσώρευση 4
µοριακών και βιολογικών χαρακτηριστικών από αποµονώσεις του ιού, καθώς και το αυξανόµενο εύρος των ξενιστών της ασθένειας, οδήγησε τους ερευνητές στον εντοπισµό πολλών νέων συγγενικών ιών αλλά και στελεχών (φυλών) τους, που κατατάχθηκαν στο γένος Begomovirus της οικογένειας Geminiviridae. Παγκόσµια διάδοση και παθογόνοι ιοί που σχετίζονται µε την ασθένεια του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας Η εύκολη διακίνηση φυτικού υλικού µε τη φιλελευθεροποίηση του διεθνούς εµπορίου, η εντατικοποίηση της µονοκαλλιέργειας, καθώς και οι µεταβολές στη θερµοκρασία του πλανήτη εξαιτίας του φαινοµένου του θερµοκηπίου αποτελούν τους κυριότερους παράγοντες για τη διάδοση των ιών της οικογένειας Geminiviridae διεθνώς. Επιπλέον, η µείωση των φυσικών εχθρών των εντόµων φορέων λόγω της αλόγιστης χρήσης των φυτοπροστατευτικών σκευασµάτων, καθώς και η ανάπτυξη ανθεκτικότητας του φορέα B. tabaci σε πολλές οµάδες γεωργικών φαρµάκων κατέστησαν τους ιούς του γένους Begomovirus ως τους σηµαντικότερους ιούς στις λαχανοκοµικές καλλιέργειες ολόκληρης της υφηλίου (Brown, 2000). Η ασθένεια του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας αποτελεί σήµερα την πιο επιζήµια ιολογική ασθένεια στις καλλιέργειες τοµάτας σε όλες τις θερµές και τροπικές περιοχές του πλανήτη, µε απώλειες που φτάνουν ακόµη και το 100% της παραγωγής (Czosnek and Latterot, 1997). Σήµερα, η ασθένεια εντοπίζεται σε όλες τις χώρες της Μεσογειακής λεκάνης (Ισραήλ, Λίβανος, Συρία, Αίγυπτος, Τουρκία, Μαρόκο, Τυνησία, Κύπρος, Ελλάδα, Ιταλία, Γαλλία, Ισπανία, Πορτογαλία). Επιπρόσθετα, έχει αναφερθεί στην Αφρική (Σουδάν, Αιθιοπία, Μαλί, Καµερούν, Τανζανία, Σενεγάλη, Γουινέα), την Ασία (Ιορδανία, Σαουδική Αραβία, Οµάν, Υεµένη, Ιράκ, Πακιστάν, Ινδία, Κίνα, Ιαπωνία, Ταϋλάνδη, Κορέα, Ινδονησία, Βιετνάµ), την Ωκεανία (Αυστραλία, Νέα Γουινέα), και την Αµερική (Ηνωµένες Πολιτείες, Μεξικό, Γουατεµάλα, Ονδούρρες, Νικαράγουα, Κολοµβία, Κούβα, ∆οµινικανή ∆ηµοκρατία, Περού, Βραζιλία, Χιλή, Αργεντινή) (European Plant Protection Organization, EPPO, www.eppo.org/QUARANTINE/TYLCVvirus). Σύµφωνα µε την τελευταία συστηµατική κατάταξη των ιών Begomovirus, που προκαλούν την ασθένεια, αναφέρονται 86 αποµονώσεις και στελέχη που ανήκουν σε 11 διαφορετικά είδη ιών διεθνώς (Πίνακας 1) (Fauquet et al., 2008). Το γονιδίωµα αυτών των ιών αποτελείται από κυκλικό δεοξυριβοζο5
Πίνακας 1. Ιοί και στελέχη του γένους Begomovirus που σχετίζονται µε την ασθένεια του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας διεθνώς Επιστηµονική ονοµασία και ακρωνύµια ιών
Tomato yellow leaf curl Axarquia virus (TYLCAxV) Tomato yellow leaf curl China virus(TYLCCNV) Tomato yellow leaf curl Guangdong virus (TYLCGuV) Tomato yellow leaf curl Indonesia virus (TYLCIV) Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV) Tomato yellow leaf curl Malaga virus (TYLCMaV) Tomato yellow leaf curl Mali virus (TYLCMV) Tomato yellow leaf curl Sardinia virus (TYLCSV) Tomato yellow leaf curl Thailand virus (TYLCTHV) Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVV) Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)
Γεωγραφική περιοχή καταγραφής των ιών
Ισπανία Κίνα Κίνα Ινδονησία Θαϋλάνδη Ισπανία Αιθιοπία, Μαλί Μεσογειακές χώρες Θαϋλάνδη, Κίνα Βιετνάµ Αµερική, Ασία, Αυστραλία, Ευρώπη, Αφρική
νουκλεϊνικό οξύ (DNA) το οποίο απαρτίζεται από 2800 περίπου βάσεις (Navot et al., 1991). Σ’ αυτό βρίσκονται κωδικοποιηµένες όλες οι γενετικές πληροφορίες για την αναπαραγωγή, τη µετάδοση, τη µετακίνηση και την πρόκληση των συµπτωµάτων στα φυτά ξενιστές (Lazarowitz, 1992; HanleyBowdoin et al., 2000). ∆ιακρίνονται δύο κύριες υποοµάδες του γένους, στις οποίες περιλαµβάνονται οι ιοί του Νέου Κόσµου (Βόρειας, Κεντρικής και Νότιας Αµερικής), των οποίων το γονιδίωµα είναι διµερές και αποτελείται από δύο κυκλικά µόρια DNA µονής αλυσίδας (DNA-A και DNA-B), και οι ιοί του Παλαιού Κόσµου (Ευρώπης, Αφρικής και Αυστραλασίας) που έχουν µονοµερές γονιδίωµα (DNA-A), από το οποίο απουσιάζει το DNA-B (Thomas et al., 1986). Στις χώρες της µεσογειακής λεκάνης, έχουν καταγραφεί τέσσερα διαφορετικά είδη ιών του γένους Begomovirus που σχετίζονται µε τις επιδηµίες της ασθένειας (Εικόνα 1). Ο ιός του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV), που έχει και τη µεγαλύτερη συχνότητα εµφάνισης στη Μεσόγειο, ο ιός του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας της Σαρδηνίας (Tomato yellow leaf curl Sardinia virus, TYLCSV), που αναφέρεται ως το δεύτερο πιο συχνά απαντώµενο είδος 6
Εικόνα 1. Γεωγραφική διάδοση των ιών του γένους Begomovirus που προκαλούν την ασθένεια του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας στις χώρες της µεσογειακής λεκάνης.
(Czosnek and Latterot 1997; Accotto et al., 2000; Papayiannis et al., 2007a), ο ιός του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας της Μάλαγας (Tomato yellow leaf curl Malaga virus, TYLCMaV), που αναφέρθηκε στην Ισπανία ως προϊόν ανασυνδυασµού και γενετικής ανταλλαγής της ισπανικής αποµόνωσης TYLCSV-ES και του ήπιου στελέχους του TYLCV (Varma and Malathi, 2003), και τέλος, ο ιός του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας της Αξάρκιας (Tomato yellow leaf curl Axarquia virus, TYLCAxV), που αναφέρθηκε στην περιοχή της Ανδαλουσίας στην Ισπανία και προήλθε από τον ανασυνδυασµό του TYLCV και του TYLCSV στο αυτοφυές είδος Solanum nigrum (Garcia-Andres et al., 2006). Στη µεσογειακή λεκάνη έχουν αναφερθεί µέχρι στιγµής δεκαέξι αποµονώσεις του ιού TYLCV, οκτώ του TYLCSV, µία του TYLCMaV και µία του TYLCAxV (Πίνακας 2). Φυτά ξενιστές και συµπτώµατα της ασθένειας Οι ιοί του γένους Begomovirus που σχετίζονται µε την ασθένεια, προσβάλλουν πολλά καλλιεργούµενα και αυτοφυή φυτά από διαφορετικές βοτανικές οικογένειες. Στην τοµάτα, όπου αναφέρονται και οι σηµαντικότερες απώλειες, η σοβαρότητα των συµπτωµάτων και οι επιπτώσεις στην παραγωγή εξαρτώνται άµεσα από το στάδιο µόλυνσης των φυτών. Εάν η µόλυνση γίνει σε πολύ νεαρό στάδιο τότε τα φυτά παραµένουν καχεκτικά, χωρίς ζωηρότητα ενώ πολύ σπάνια παράγουν καρπούς. Επιπλέον, τα φυτά εµφανίζουν 7
Πίνακας 2. Ιοί, στελέχη, χώρα αναφοράς και αριθµοί καταχώρησης στη διεθνή βάση νουκλεοτιδιακών δεδοµένων (National Center of Biotechnology Information, NCBI) των ιών του γένους Begomovirus που σχετίζονται µε την ασθένεια του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας στη µεσογειακή λεκάνη
Ιοί και ακρωνύµια στελεχών
Tomato yellow leaf curl Axarquia virus (TYLCAxV) TYLCAxV-[ES:Alg:00] Tomato yellow leaf curl Malaga virus (TYLCMaV) TYLCMalV- [ES:421:99] Tomato yellow leaf curl Sardinia virus (TYLCSV) TYLCSV-Sar[IT:Sar:88] TYLCSV-Sic[IT:Sic] TYLCSV-Sic[Reh:05] TYLCSV-Sic[TN:Bka3:02] TYLCSV-Es[MA:Aga:02] TYLCSV-Es[Es:Alm2:92] TYLCSV-Es[ES:Can] TYLCSV-Es[Es:Murl1:92] Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) TYLCV-IL [EG:Ism] TYLCV-IL[EG:Nob:91] TYLCV-IL [IL:Reo:86] TYLCV-IL[IT:Sic:04] TYLCV-IL [JO:Tom:05] TYLCV-IL[LB:Tom:05] TYLCV-IL[MO :Ber :05] TYLCV-IL [ES:Alm:Pep:99] TYLCV-IL[TN:05] TYLCV-IL [TR:Mer:05] TYLCV-Mld[IL:93] TYLCV-Mld[JO:Hom] TYLCV-Mld[JO:Tom] TYLCV-Mld[ILB:LBA44:05] TYLCV-Mld[PT:2:95] TYLCV-Mld[ES:72:97] TYLCV-Mld[ES:Alm:99]
Αριθµός καταχώρησης στη διεθνή βάση Χώρα αναφοράς NCBI Ισπανία
AY227892
Σαρδηνία Σικελία Ισραήλ Τυνησία Ισπανία Ισπανία Ισπανία Ισπανία
X61153 Z28390 DQ845787 AY736854 AY702650 L27708 AJ519675 Z25751
Ισπανία
Αίγυπτος Αίγυπτος Ισραήλ Σικελία Ιορδανία Λίβανος Μαρόκκο Ισπανία Τυνησία Τουρκία Ισραήλ Ιορδανία Ιορδανία Λίβανος Πορτογαλία Ισπανία Ισπανία
AF271234
AY594174 EF107520 X15656 DQ144621 EF054893 EF051116 EF060196 AJ489258 EF101929 AJ812277 X76319 AY594175 EF054894 EF185318 AF105975 AF071228 AJ519441
έντονο νανισµό, παραµόρφωση και καρούλιασµα των φύλλων προς τα πάνω ή προς τα κάτω (Εικόνα 2). Τα φύλλα παρουσιάζονται µικρότερα και παραµορφωµένα εξαιτίας της περιθωριακής συστροφής που προκαλείται, ενώ χαρακτηριστική είναι η εµφάνιση µεσονεύριας χλώρωσης ή κιτρινίσµατος στην άκρη του ελάσµατος των φύλλων (Εικόνα 3). Οι καρποί που παράγονται στα προσβεβληµένα φυτά είναι ποιοτικά υποδιαίστερα, µικρότεροι σε µέγεθος, και λιγότεροι σε αριθµό εξαιτίας της έντονης ανθόπτωσης, µε αποτέλε8
δυνατότητα να µολύνουν αρκετά είδη πιπεριάς (Capsicum annuum, C. chilensis), τόσο στον αγρό όσο και στο εργαστήριο (Morilla et al., 2005; Polston et al., 2006). Στις περιπτώσεις που οι προσβεβληµένες πιπεριές παρουσιάζουν συµπτώµατα, αυτά περιλαµβάνουν χλώρωση, λεύκανση νεύρων και καρούλιασµα των φύλλων (Εικόνα 4). Σε µολυσµένα φυτά φασολιάς (Phaseolοus vulgaris) παρουσιάζονται συµπτώµατα µικροφυλλίας, έντονου καρουλιάσµατος στα φύλλα, ενώ ορισµένες φορές δύναται να προκληθεί και κιτρίνισµα στο παραµορφωµένο έλασµα των φύλλων (Εικόνα 5). Το σύµπλοκο των συµπτωµάτων από τον TYLCV στη φασολιά αναφέρεται και ως ασθένεια του κατσαρώµατος των φύλλων (leaf crumble) (Lapidot M., 2002; Papayiannis et al., 2007b). Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι o TYLCV µπορεί να προσβάλει και διάφορα είδη κολοκυνθοειδών (Cucurbitaceae) όπως η αγγουριά και η κολοκυθιά. Τα προσβεβληµένα φυτά της αγγουριάς (Cucumis sativus) και της κολοκυθιάς (Cucurbita maxima) παρουσιάζουν καρούλιασµα των νεαρών φύλλων το οποίο συνοδεύεται από χλώρωση (Zubiaur-Martinez et al., 2004). Επιπλέον, ο TYLCV ανιχνεύτηκε σε πετούνιες (Petunia hybrida), λυσίανθο (Eustoma grandiflorum), ιβίσκο (Hibiscus sp.), καπνό (Nicotiana tabacum), καθώς και σε αρκετά είδη αγριοτοµάτας. Ο ιός έχει εντοπιστεί σε αρκετά είδη ζιζανίων που ανήκουν στις οικογένειες Aizοaceae, Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Convolvulaceae, Cruciferae, Euphorbiaceae, Leguminosae, Plantaginaceae, Malvaceae και Solanaceae (Ioannou 1987, Bedford et al., 1998, Abou-Jawdah et al., 1999, Sanchez-Campos et al., 1999, Jorda et al., 2001, Kashina et al.,
Εικόνα 4. Συµπτώµατα καρουλιάσµατος σε φύλλα πιπεριάς µολυσµένης µε TYLCV.
10
Εικόνα 5. Παραµόρφωση και συστροφή των φύλλων φασολιάς προσβεβληµένης µε TYLCV.
2002, Salati et al 2002, Rojas et al., 2007; Papayiannis et al., 20011). Σε αντίθεση µε τα καλλιεργούµενα φυτά, ο ιός σπάνια προκαλεί εµφανή συµπτώµατα σε αυτοφυή φυτά τα οποία όµως µπορεί να έχουν ένα σηµαντικό ρόλο στην επιδηµιολογία της ασθένειας (Ioannou 1987; Salati et al 2002, Rojas et al., 2007; Papayiannis et al., 2011). Ανίχνευση και ταυτοποίηση των ιών του γένους Begomovirus που σχετίζονται µε την ασθένεια Παρά το γεγονός ότι οι ιοί του γένους Begomovirus που σχετίζονται µε την ασθένεια του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας προκαλούν χαρακτηριστικά συµπτώµατα σε αρκετές ποικιλίες τοµάτας, η ακριβής ταυτοποίηση και ο προσδιορισµός των διαφόρων ειδών των ιών απαιτεί την εφαρµογή σύγχρονων εργαστηριακών δοκιµών. Η πρώτη µέθοδος διάγνωσης στηρίχτηκε σε τεχνητές δοκιµές µετάδοσης του ιού TYLCV από τα ύποπτα φυτά σε νεαρά υγιή φυτά τοµάτας µε τη χρήση των αλευρωδών φορέων του είδους B. tabaci (Cohen and Nitzany, 1966; Ioannou, 1985). Η µέθοδος, παρά το γεγονός ότι είχε ευρεία εφαρµογή κατά τις δεκαετίες 1960-1980, σήµερα δεν χρησιµοποιείται τουλάχιστο για σκοπούς διάγνωσης, εξαιτίας του µεγάλου χρονικού διαστήµατος που απαιτείται για την εκδήλωση των συµπτωµάτων και της επίπονης και υψηλού κόστους διαδικασίας εκτροφής των εντόµων φορέων, καθώς και του πολλαπλασιασµού των φυτών δεικτών. Η χρησιµοποίηση του ηλεκτρονικού µικροσκοπίου και η παρατήρηση της δοµής των 11
ιοσωµατίων σε λεπτές τοµές προσβεβληµένων φύλλων εφαρµόστηκε στις αρχές της δεκαετίας του 1980, κυρίως στα πλαίσια της προσπάθειας προσδιορισµού και εντοπισµού των θέσεων των σωµατιδίων του ιού στους φυτικούς ιστούς (Russo et al., 1980). Παρόλα αυτά, το υψηλό κόστος του εξοπλισµού και η δυσκολία προετοιµασίας των δειγµάτων αποτέλεσαν απαγορευτικούς παράγοντες για την καθιέρωση της ηλεκτρονικής µικροσκοπίας ως διαγνωστικό εργαλείο ρουτίνας. Η επιτυχής αποµόνωση και ο καθαρισµός των ιοσωµατίων το 1988 έδωσε τη δυνατότητα για παραγωγή αντισωµάτων και την ανάπτυξη ορολογικών δοκιµών, όπως η ανοσοπροσροφική δοκιµή ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay) (Al-Bitar and Luisoni, 1995). Η µέθοδος δεν παρουσιάζει ιδιαίτερη επιτυχία για διαγνωστικούς σκοπούς, εξαιτίας της µεγάλης δυσκολίας που απαιτείται για τον καθαρισµό των ιών Begomovirus σε συνδυασµό µε τη µικρή ικανότητα επαγωγής αντισωµάτων στα θηλαστικά. Επιπλέον, παρουσιάζει µειωµένη ευαισθησία, κυρίως όταν στους ιστούς των υπό εξέταση φυτών η συγκέντρωση των ιοσωµατίων είναι σε µη ανιχνεύσιµα επίπεδα, ενώ συνήθως αδυνατεί να προσδιορίσει διαφορετικά είδη και στελέχη (Dalmon et al., 2000; Crescenzi et al., 2004). Τα τελευταία χρόνια, η ραγδαία ανάπτυξη της µοριακής βιολογίας οδήγησε στην υιοθέτηση νέων διαγνωστικών εργαλείων. Η εφαρµογή της συµβατικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης (Polymerase chain reaction, PCR), σε συνδυασµό µε άλλες συναφείς τεχνικές, έδωσε τη δυνατότητα για πιο ευαίσθητη και αξιόπιστη ανίχνευση, ταυτοποίηση και χαρακτηρισµό των ιών που σχετίζονται µε την ασθένεια (Accotto et al., 2000; Martinez-Culebras et al., 2001; Gorsane et al., 2005; Anfoka et al., 2005; Davino et al., 2008). Εκτός της PCR, ευρεία εφαρµογή βρίσκει σήµερα η ενίσχυση κυλιόµενου κύκλου (RCA) η οποία µιµείται το µηχανισµό αντιγραφής των ιών µε τη χρήση της DNA πολυµεράσης του βακτηρίου Bacillus subtilis Φ 29 και δίνει τη δυνατότητα για τον πολλαπλασιασµό ολόκληρου του γονιδιώµατος των ιών Begomovirus (Inoue-Nagata et al., 2004; Garcia-Andres et al., 2006). Πρόσφατα, τα συστήµατα PCR πραγµατικού χρόνου τυγχάνουν επίσης ευρείας εφαρµογής για την ταυτοποίηση και το διαχωρισµό των ιών, αφού παρέχουν τη δυνατότητα αυξηµένης ευαισθησίας µέχρι και 1000 φορές έναντι της συµβατικής PCR, δίνοντας παράλληλα τη δυνατότητα για ποσοτικοποίηση του ιικού φορτίου σε φυτά ξενιστές και αλευρώδεις φορείς (Mason et al., 2008; Papayiannis et al., 2010a). Τέλος, η χρήση µικροσυστοιχιών DNA έχει αναφερθεί για την ταυτόχρονη ανίχνευση τουλάχιστον 10 διαφορετικών ιών που 12
προσβάλλουν την τοµάτα, µεταξύ των οποίων ο TYLCV και ο TYLCSV, χωρίς ωστόσο να είναι δυνατή η διαφοροποίηση τους (Tiberini et al., 2010). Παρουσία και διερεύνηση της ασθένειας στην Κύπρο Στην Κύπρο η ασθένεια παρατηρήθηκε για πρώτη φορά σε υπαίθριες καλλιέργειες τοµάτας το 1974 και αποδόθηκε στον TYLCV, σύµφωνα µε τα βιολογικά χαρακτηριστικά, τη συµπτωµατολογία των ασθενών φυτών και τον τρόπο µετάδοσης της (Ioannou, 1985). Πιστεύεται ότι ήρθε στο νησί µε πληθυσµούς ιοφόρων αλευρωδών που παρασύρθηκαν από τον άνεµο από το Ισραήλ, ή από άλλες γειτονικές χώρες. Αρχικά εντοπίστηκε σε παράκτιες φυτείες τοµάτας της περιοχής των Κοκκινοχωρίων στην επαρχία Αµµοχώστου, ενώ αργότερα διαδόθηκε και στις άλλες επαρχίες (Λάρνακας, Λεµεσού, Πάφου και Λευκωσίας), προκαλώντας σηµαντικές οικονοµικές απώλειες (Ioannou, 1985). Σήµερα, αποτελεί τη σοβαρότερη ιολογική ασθένεια της τοµάτας στην Κύπρο και είναι ευρέως διαδεδοµένη σε όλες τις περιοχές υπαίθριας και θερµοκηπιακής καλλιέργειας τοµάτας (Papayiannis et al., 2008; Papayiannis et al., 2009b; Παπαγιάννης κ.α., 2010). Στα πλαίσια των ερευνητικών δραστηριοτήτων του ΙΓΕ Κύπρου µέσα από εθνικά, διακρατικά και ευρωπαϊκά προγράµµατα χρηµατοδότησης, έχουν γίνει τα τελευταία χρόνια αρκετές µελέτες αναφορικά µε την ταυτοποίηση, το χαρακτηρισµό και την επιδηµιολογία των ιών που σχετίζονται µε την ασθένεια στην Κύπρο. Σε συνεργασία µε τη Σχολή Φυτικών Επιστηµών του Πανεπιστηµίου της Αριζόνας και της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, αναπτύχθηκε µια καινοτόµος διαγνωστική δοκιµή, η οποία δίνει τη δυνατότητα για την ταυτόχρονη ανίχνευση και το διαχωρισµό των δύο πιο διαδεδοµένων ιών που σχετίζονται µε την ασθένεια στην Ευρώπη και τη Μεσόγειο (Papayiannis et al., 2010). Η µέθοδος αναφέρεται στο σχεδιασµό ειδικών µοριακών ανιχνευτών τύπου TaqMan®, κατάλληλων για χρήση στα συστήµατα PCR πραγµατικού χρόνου που µπορούν να ανιχνεύουν την παρουσία του TYLCV και του TYLCSV σε µία µόνο αντίδραση και να µετρούν παράλληλα την ποσότητα του ιικού φορτίου σε διάφορα φυτά ξενιστές, καθώς και σε αλευρώδεις φορείς των ιών (Εικόνα 6). Η αυξηµένη ευαισθησία της µεθόδου έχει ως αποτέλεσµα την επιτυχή ανίχνευση των δύο ιών σε φυτικά εκχυλίσµατα αποτυπωµένα σε ειδική νάιλον µεµβράνη, χωρίς να απαιτείται η χρονοβόρα αποµόνωση του φυτικού DNA. Επιπλέον, η επιτυχής αξιολόγηση της µεθόδου σε αποµονώσεις από την Ισπανία, την Πορτογαλία, 13
Εικόνα 6. ∆ιαδικασία εργαστηριακής ταυτοποίησης του ιού TYLCV µε τα συστήµατα PCR πραγµατικού χρόνου.
την Ιταλία, την Ελλάδα, την Τουρκία, την Ιορδανία, το Ισραήλ την Ιαπωνία και τις Ηνωµένες Πολιτείες Αµερικής έδειξε ότι µπορεί να αποτελέσει ένα χρήσιµο διαγνωστικό εργαλείο για την ανίχνευση διαφορετικών αποµονώσεων των ιών σε διεθνές επίπεδο (Papayiannis et al., 2010a). Τέλος, σηµειώνεται ότι η µέθοδος που αναπτύχθηκε είναι κατά τουλάχιστον 10000 και 100 φορές πιο ευαίσθητη από τις δοκιµές ELISA και της συµβατικής PCR (Εικόνα 7), αντίστοιχα και µπορεί να ανιχνεύσει τους ιούς σε ιδιαίτερα µικρές συγκεντρώσεις σε φυτικά είδη που αποτελούν εναλλακτικούς ξενιστές (Papayiannis et al., 2011). Στα πλαίσια µιας άλλης µελέτης διερευνήθηκε η παρουσία των ιών του γένους Begomovirus που σχετίζονται µε την ασθένεια του κίτρινου καρουλιάσµατος στην Κύπρο. Κατά την περίοδο 2006-2010 πραγµατοποιήθηκε συλλογή και ανάλυση 1500 δειγµάτων από υπαίθρια και υπό κάλυψη φυτά τοµάτας που παρουσίαζαν συµπτώµατα καρουλιάσµατος, παραµόρφωσης των φύλλων και νανισµού των φυτών, καθώς και δείγµατα άλλων καλλιεργούµενων φυτικών ειδών. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι ο TYLCV αποτελεί το µοναδικό ιό του γένους Begomovirus που εντοπίζεται στη µεγαλόνησο. Ο ιός ανιχνεύτηκε σε όλα τα φυτά τοµάτας που παρουσίαζαν τα χαρακτηριστικά συµπτώµατα. Όσο αφορά σε άλλα καλλιεργούµενα είδη, ο ιός εντοπίστηκε σε καλλιέργειες πιπεριάς και φασολιάς που παρουσίαζαν στα φύλλα συµπτώµατα παραµόρφωσης και καρουλιάσµατος, λεύκανσης νευρώσεων και περινεύ14
Εικόνα 7. Σύγκριση της ευαισθησίας ανίχνευσης του ιού TYLCV µε την ανοσοενζυµική δοκιµή ELISA, τη συµβατική και την πραγµατικού χρόνου PCR.
ρια χλώρωσης, τα οποία γειτνίαζαν µε προσβεβληµένα φυτά τοµάτας. Ο περαιτέρω µοριακός χαρακτηρισµός διαφόρων αποµονώσεων του ιού από δείγµατα συµπτωµατικών φυτών τοµάτας, καθώς και άλλων ξενιστών, έδειξε ότι στην Κύπρο εντοπίζονται τόσο τα Ισραηλινά (Israel) όσο και τα ήπια (Mild) στελέχη (φυλές). Η µελέτη της πλήρους γονιδιακής αλληλουχίας του DNA και η φυλογενετική ανάλυση των κυπριακών πληθυσµών του ιού κατέδειξε την ιδιαίτερα υψηλή οµοιότητα των αποµονώσεων µε αντίστοιχα στελέχη που κυριαρχούν σε Ισραήλ, Λίβανο, και άλλες χώρες της Μέσης Ανατολής (Εικόνα 8) (Παπαγιάννης κ.α., 2010). Η εφαρµογή της νέας τεχνολογίας για την ανίχνευση του ιού έδειξε ότι εκτός από τα καλλιεργούµενα φυτά, ο TYLCV εντοπίζεται και σε πολλά ζιζάνια που φύονται εντός και περιφερειακά των προσβεβληµένων καλλιεργειών τοµάτας. Σε σύνολο 4000 δειγµάτων από ζιζάνια, που συλλέχθηκαν κατά τυχαίο τρόπο από τρεις περιοχές της Κύπρου (Παρεκκλησιά, Κίτι και Μαντριά) και αναλύθηκαν µε τη χρήση ορολογικών και µοριακών δοκιµών, εντοπίστηκαν να είναι θετικά στον ιό κάτω από φυσικές συνθήκες 49 διαφορετικά είδη που ανήκουν σε 15 βοτανικές οικογένειες, σε ποσοστό 11.5% (Πίνακας 3) (Papayiannis et al., 2011). Αντίστοιχα, ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης των ιοσωµατίων στους εναλλακτικούς αυτούς ξενιστές έδειξε ότι παρατηρείται µεγάλη διακύµανση του ιικού φορτίου στους ιστούς τους. Φυτικά είδη που ανήκουν στην οικογένεια Solanaceae έχουν γενικά τη µεγα15
Εικόνα 8. Φυλογενετική ανάλυση της νουκλεοτιδιακής αλληλουχίας αποµονώσεων του TYLCV από την Κύπρο (CY1-CY10) και το εξωτερικό (βλέπε και Πίνακα 2).
λύτερη συγκέντρωση ιοσωµατίων, ενώ τα είδη των οικογενειών Urticaceae και Chenopodiaceae τη µικρότερη. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι το εύρος των ζιζανίων-ξενιστών στην Κύπρο είναι κατά πολύ µεγαλύτερο σε σχέση µε παλαιότερες µελέτες που έγιναν κατά τη δεκαετία του 1980 στις οποίες δεν υπήρχε η δυνατότητα εφαρµογής ευαίσθητων τεχνικών ανίχνευσης (Ioannou et al., 1987). Ο ρόλος των ζιζαίων στη διατήρηση του ιικού µολύσµατος αξιολογήθηκε πρόσφατα σε µια σειρά πειραµάτων µετάδοσης που πραγµατοποιήθηκαν στο Εντοµοτροφείο του ΙΓΕ (συνεργασία µε Ν. Σεραφείδη). Τα προκαταρκτικά αποτελέσµατα απέδειξαν ότι µη ιοφόροι αλευρώδεις δύνανται να προσλάβουν τον ιό από ζιζάνια που µολύνθηκαν τεχνητά και να τον µεταδώσουν σε 16
Euphorbiaceae
Cruciferae
Convolvulaceae
Compositae
Chenopodiaceae
Amaranthaceae
Οικογένεια
Amaranthus retroflexus Amaranthus viridis Amaranthus graecizans Chenopodium album Chenopodium murale Asteriscus aquaticus Calendula arvensis Chrysanthemum coronarium Chrysanthemum segetum Conyza bonariensis Matricaria recutita Onopordum cyprium Silybum marianum Sonchus asper Sonchus oleraceus Sonchus tenerrimus Urospermum picroides Convolvulus arvensis Convolvulus humilis Cuscuta spp. Hirschfeldia incana Raphanus raphanistrum Raphanus sativus Sinapis alba Sinapis arvensis Chrozophora tinctoria Euphorbia helioscopia
Φυτικό είδοςΑ
2/63 6/48 8/52 12/62 9/51 10/45 37/137 12/66 6/46 5/35 9/56 2/13 3/18 9/31 14/87 2/20 8/25 16/76 8/45 2/7 1/21 18/79 6/18 12/61 11/81 2/17 4/20
Θετικά/ ΣυνολοΒ
Τραχύ Βλήτο Λεπτό Βλήτο Άγριο Βλήτο Λουβουδιά Πράσινη Λουβουδιά Αστερίσκος ο υδροχαρής Καλεντούλα Μαργαρίτα Αγριοµαργαρίτα Κόνυζα Χαµοµήλι Γαϊδουράγκαθο Κουφάγκαθο Τραχύς ζωχός Κοινός ζωχός Ζωχός Πικρίθρα Περιπλοκάδα Περιπλοκάδα Κουσκούτα Μαύρη Βρούτα Ραπανίδα Ραπανάκι Ήµερο σινάπι Άγριο σινάπι Χρωζοφόρα Γαλατσίδα
Κοινό όνοµα
1.2 1.3 1.1 1.1 1.3 -
ELISAΓ
++ ++ ++ + + ++ +++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ +++ +++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ -
PCR∆
26 27 28 29 29 19 17 21 18 25 27 31 28 23 25 22 20 19 21 23 24 22 25 21 24 22 30
TaqMan PCRΕ
Πίνακας 3. Ζιζάνια που εντοπίστηκαν να είναι φυσικοί ξενιστές του ιού TYLCV στην Κύπρο και ικανότητα ανίχνευσης του ιού µε τρείς διαφορετικές διαγνωστικές τεχνικές
Mercurialis annua Erodium ciconium Erodium cicutarium Lotus edulis Lotus halophilus Scorpiurus muricatus Lavatera cretica Malva cretica Malva neglecta Malva nicaeensis Malva parviflora Malva sylvestris Orobanche ramosa Plantago lagopus Plantago major Anagallis arvensis Datura innoxia Datura stramonium Solanum nigrum Solanum villosum Scandix pecten-veneris Urtica urens Σύνολο Μυρώνι Τσουκνίδα µικρή
Σκαρολάχανο Κύκνιος Βελανίδα Κοινή Βελανίδα Σκορπίουρος Λαβατέρα η κριτική Μάλβα η κριτική Μάλβα Μάλβα η νικαένσια Μάλβα η µικρανθής Κοινή µολόχα Οροβάχα Μικρό πεντάνευρο Πλαντάκο το µέϊζον Αναγαλλίδα Τάτουλας Τατούλας Αγριοτοµατιά
1/7 2/24 1/19 5/26 8/39 14/81 3/26 8/54 30/178 22/151 19/131 11/81 3/17 4/37 8/45 16/82 5/12 18/41 28/137 6/32 6/33 9/72 461/3976
0.4 0.6 0.6 0.4 0.3 1.7 1.6 1.9 1.5 -
++ ++ + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ + +++ +++ +++ ++ ++ -
29 25 28 30 29 24 26 28 25 26 29 27 26 23 20 27 18 16 18 22 25 31
µέτρησης στα 405 nm, ενώ η ένδειξη– σηµειώνεται για τα δείγµατα στα οποία δεν ήταν δυνατή η ανίχνευση µε ELISA. ∆Αποτελέσµατα συµβατικής PCR. Τα πρόσηµα αναφέρονται στην ένταση της ζώνης ηλεκτροφόρησης που λήφθηκαν: - = µη εµφανής ζώνη, + = ασθενής ζώνη, ++ = εµφανής ζώνη, +++ = έντονη ζώνη. ΕΜέσος όρος των κύκλων ανίχνευσης µε τη µέθοδο (TaqMan PCR). Ο µικρότερος κύκλος ανίχνευσης αναφέρεται σε µεγαλύτερη ικανότητα ανίχνευσης.
ΑΤα είδη που αναφέρονται ως νέοι ξενιστές του ιού στην Κύπρο δίνονται µε έντονη γραφή. ΒΑριθµός προσβεβληµένων φυτών/Συνολικό αριθµό φυτών που ελέγχθηκαν. ΓΑποτελέσµατα ορολογικών δοκιµών. Οι τιµές αναφέρονται στη µέση οπτική πυκνότητα της
Umbelliferae Urticaceae
Primulaceae Solanaceae
Orobanchaceae Plantaginaceae
Malvaceae
Leguminoseae
Geraniaceae
υγιή φυτά τοµάτας (Παπαγιάννης κ.α., 2010). H παρουσία του ιού σε αυτοφυή είδη, είναι πιθανό να σχετίζεται µε τη διατήρηση του µολύσµατος σε περιόδους όπου δεν καλλιεργείται τοµάτα, και συνεπώς να διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στην επιδηµιολογία της ασθένειας. Η αντιµετώπιση αυτών των αυτοφυών εναλλακτικών ξενιστών του TYLCV µπορεί να περιορίσει σηµαντικά την προσβολή από τον ιό αυτό και κατ’ επέκταση το µέγεθος της ζηµιάς. Ο εντοπισµός του ιού στο παρασιτικό φυτό οροβάγχης (Phelipanche sp. παλαιότερα γνωστό µε την ονοµασία Orobanche sp.) στην Κύπρο αποτέλεσε αντικείµενο συνεργασίας µεταξύ του ΙΓΕ και του Ερευνητικού Κέντρου Volcani στο Ισραήλ. Εκτεταµένες µελέτες που έγιναν από ερευνητές των δύο Ινστιτούτων απέδειξαν για πρώτη φορά διεθνώς ότι η οροβάγχη κατά τον παρασιτισµό µολυσµένων µε TYLCV φυτών τοµάτας, εκτός από τα θρεπτικά συστατικά που απορροφά, έχει την ικανότητα να προσλαµβάνει και ιοσωµάτια διαφόρων ιών, µεταξύ των οποίων και του TYLCV (Εικόνα 9). Στα πειράµατα που πραγµατοποιήθηκαν, εντοπίστηκαν αναπαραγωγικές µορφές του ιού στα παρασιτικά φυτά του είδους Phelipanche aegyptiaca που αναπτύχθηκαν κάτω από τεχνητές συνθήκες σε µολυσµένα φυτά τοµάτας. Αξιοσηµείωτο είναι ότι τα ιωµένα φυτά οροβάγχης παρουσίασαν µειωµένη ανάπτυξη και αριθµό βλαστών σε σχέση µε τα υγιή, γεγονός που υποδηλώνει την επίδραση του TYLCV στην ανάπτυξη των παρασιτικών φυτών. Τέλος, ο ιός ανιχνεύτηκε και σε σπόρους που αναλύθηκαν από τα µολυσµένα φυτά οροβάγχης (GalΟn et al., 2010).
Εικόνα 9. Παρασιτισµός τοµάτας προσβεβληµένης µε TYLCV από οροβάγχη.
19
Ο ΑΛΕΥΡΩ∆ΗΣ ΤΟΥ ΚΑΠΝΟΥ ΩΣ ΦΟΡΕΑΣ ΤΩΝ ΙΩΝ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΤΗΝ ΑΣΘΕΝΕΙΑ ΤΟΥ ΚΙΤΡΙΝΟΥ ΚΑΡΟΥΛΙΑΣΜΑΤΟΣ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ ΤΟΜΑΤΑΣ Οι αλευρώδεις Οι αλευρώδεις είναι µικροσκοπικά έντοµα τα οποία ανήκουν στην οικογένεια Aleyrodidae της τάξης Hemiptera, υποτάξης Homoptera και της σειράς Sternorrhyncha (Mound and Halsey, 1978; Campbell et al., 1994). Τα έντοµα αυτά παρουσιάζουν παραµετάβολη µεταµόρφωση, δηλαδή ο βιολογικός τους κύκλος αποτελείται από τρία στάδια (αυγό, ανήλικες προνυµφικές µορφές και ενήλικο). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει ο απλοδιπλοειδής τρόπος αναπαραγωγής τους, κατά τον οποίο τα αρσενικά απλοειδή άτοµα προκύπτουν από αγονιµοποίητα αυγά (παρθενογενετική αρρενοτοκία), ενώ αντίστοιχα τα θηλυκά διπλοειδή άτοµα προέρχονται από γονιµοποιηµένα αυγά (Blackman and Cahill, 1998; Byrne and Bellows, 1991). Ένα άλλο σηµαντικό χαρακτηριστικό των αλευρωδών, καθώς και άλλων εντόµων της υπόταξης Homoptera, είναι η παρουσία ενδοσυµβιωτικών βακτηρίων στον οργανισµό τους. Οι αλευρώδεις κατατάσσονται ανάµεσα στους σηµαντικότερους εντοµολογικούς εχθρούς των φυτών γεωργικής σηµασίας, προκαλώντας σηµαντικές οικονοµικές απώλειες. Οι ζηµιές που προκαλούν µπορεί να είναι άµεσες λόγω της µύζησης φυτικού χυµού (Campbell, 1994), αλλά και έµµεσες αφού έχουν την ικανότητα να µεταδίδουν πολλούς φυτικούς ιούς (Jones, 2003). Το σύµπλεγµα του αλευρώδη του καπνού, B. tabaci (Gennadius) Μέχρι στιγµής, έχουν αναφερθεί και καταγραφεί περισσότερα από 1200 διαφορετικά είδη αλευρωδών διεθνώς και ανάµεσα τους βρίσκεται το είδος B. tabaci (Gennadius) που κατέχει µια ξεχωριστή και αξιοσηµείωτη θέση. Ευρύτερα γνωστό µε την κοινή ονοµασία αλευρώδης του καπνού (tobacco whitefly) ή αλευρώδης της γλυκοπατάτας (sweet potato whitefly), το είδος B. tabaci αποτελεί ένα από τους σηµαντικότερους γεωργικούς εντοµολογικούς εχθρούς του πλανήτη (Εικόνα 10). Αναφέρθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα από το Γεννάδιο να προσβάλλει και να τρέφεται σε φυτά καπνού (Nicotiana tabacum) το 1890 και η πρώτη ονοµασία του ήταν Aleyrodes tabaci (Gennadius, 1890). Ο βιολογικός κύκλος του εντόµου περιλαµβάνει τα στάδια του αυγού, της προνύµφης (η οποία διέρχεται από τέσσερις ανήλικες µορφές) και του ενηλίκου. Έχει διάρκεια 15-60 ηµέρες και εξαρτάται άµεσα από τη 20
Εικόνα 10. Ενήλικα άτοµα του αλευρώδη του καπνού (Bemisia tabaci Gennadius).
θερµοκρασία, τη φωτοπερίοδο και το φυτό ξενιστή στο οποίο αναπτύσσεται (Gerling et al., 1986). Στις Μεσογειακές χώρες, το έντοµο παρουσιάζει συνήθως 10-15 γενεές ανά έτος. Το B. tabaci είναι ένα πολυφάγο έντοµο και µπορεί να τραφεί σε περισσότερα από 600 φυτικά είδη που ανήκουν σε 65 βοτανικές οικογένειες (Mound and Halsey, 1978). Οι άµεσες ζηµιές που προκαλεί στα φυτά ξενιστές, επιφέρονται από όλα τα στάδια ανάπτυξης του εντόµου (εκτός του αυγού) και οφείλονται στη µύζηση του φυτικού χυµού που έχει ως αποτέλεσµα την εξασθένιση των φυτών, την προοδευτική µάρανση της φυλλικής επιφάνειας και τελικά τη ξήρανση του φυτού. Επιπλέον, τα µελιτώδη αποχωρήµατα που εναποτίθενται στα διάφορα µέρη του φυτού αποτελούν υπόστρωµα για την ανάπτυξη των µυκήτων της καπνιάς, γεγονός που οδηγεί στη µείωση της φωτοσυνθετικής ικανότητας και την υποβάθµιση της εµπορικής αξίας των φυτικών προϊόντων. Η προσβολή από ορισµένους τύπους αλευρώδη σχετίζεται µε την εµφάνιση φυτοτοξικών αλλοιώσεων, όπως η ασηµόχρωση των φύλλων της κολοκυθιάς, η ανοµοιόµορφη ωρίµανση των καρπών της τοµάτας (Yokomi et al., 1990) και η λεύκανση νεύρων της ποϊνσέττιας (Brown et al., 1995). Σήµερα, αναφέρονται περισσότερες από 120 ιολογικές ασθένειες που µεταδίδονται µε τον αλευρώδη B. tabaci διεθνώς και ανήκουν στα γένη Begomovirus, Crinivirus και Ipomovirus (Jones, 2003). 21
Ανάµεσα στα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των αλευρωδών, αλλά γενικότερα των ηµιπτέρων εντόµων, είναι και η ικανότητα τους να συµβιώνουν µε αρκετά είδη βακτηρίων, τα οποία έχουν διάφορους λειτουργικούς ρόλους (Baumann, 2005). Τα βακτήρια αυτά συσσωρεύονται σε εξειδικευµένα κύτταρα των εντόµων σε κοιλότητες στο εσωτερικό της κοιλίας, που καλούνται βακτηριοκύτια (bacteriocytes) (Costa et al., 1993; Zchori-Fein and Brown, 2002; Thao and Bauman, 2004). ∆ιακρίνονται δύο τύποι ενδοσυµβιωτικών βακτηρίων, τα πρωτογενή ενδοσυµβιωτικά (Primary, P-endosymbionts) και τα δευτερογενή ενδοσυµβιωτικά (Secondary, S-endosymbionts). Τα πρωτογενή συναντώνται σε όλα τα άτοµα του κάθε είδους, µεταδίδονται από τη µητέρα στους απογόνους µε τα αυγά και η παρουσία τους είναι απαραίτητη για την επιβίωση των εντόµων. Συγκεκριµένα, τα µεν βακτήρια συνθέτουν απαραίτητα αµινοξέα, τα οποία δεν µπορούν να ληφθούν σε ικανοποιητικές ποσότητες από τα φυτά ξενιστές, ενώ τα έντοµα προσφέρουν καταφύγιο και µεταβολικούς πόρους (Campbell, 1993; Thao et al., 2004). Στο είδος B. tabaci, το πρωτογενές ενδοσυµβιωτικό βακτήριο είναι το Candidatus Portiera aleyrodidarym που ανήκει στα γ-proteobacteria και συναντάται υποχρεωτικά σε όλους τους βιότυπους (Thao and Baumann, 2004). Τα δευτερογενή ενδοσυµβιωτικά βακτήρια διαφέρουν στον κάθε πληθυσµό και φαίνεται να σχετίζονται άµεσα ή έµµεσα µε την περιβαλλοντική προσαρµογή, τη συµπεριφορά και τη σύζευξη των εντόµων (Leonardo and Mondor, 2006), τη βιοσύνθεση εξειδικευµένων αµινοξέων (Campbell and Dreyer, 1985), την πρόκληση φυτοτοξικότητας στα φυτά ξενιστές (Costa et al., 1993), την αντοχή στις υψηλές θερµοκρασίες (Montllor et al., 2002), την ικανότητα µετάδοσης ιολογικών ασθενειών (Morin et al., 2000; Gottlieb et al., 2010) ή ακόµη και µε τη δυσµενή επίδραση στη βιολογία και την αναπαραγωγική τους ικανότητα (Brown, 2007). Στο είδος B. tabaci τα δευτερογενή ενδοσυµβιωτικά είδη που συναντώνται είναι τα Candidatus Hamiltonella defense, Arsenophonus sp. (γproteobacteria) (Thao and Baumann, 2005; Chiel et al., 2007), Rickettsia sp., Wolbachia spp. (α-proteobacteria) (Gottlieb et al., 2006; Chiel et al., 2007), Candidatus Cardinium hertigii (Bacteriodetes) (Baumann et al., 2003; Chiel et al., 2007) και το Candidatus Fritshchea bemisiae (Chlamidiales) (Zchori-Fein and Brown, 2002; Everett et al., 2005). 22
Βιότυποι και γενετική παραλλακτικότητα του είδους B. tabaci Το είδος B. tabaci αποτελεί ένα εξαίρετο παράδειγµα κρυπτικού είδους (cryptic species), αφού παρά το γεγονός ότι τα ενήλικα άτοµα διαφορετικών πληθυσµών έχουν συνήθως γενετική παραλλακτικότητα και διαφορές σε µοριακό επίπεδο, δεν παρουσιάζουν διακριτούς µορφολογικούς χαρακτήρες. Ωστόσο, έχει παρατηρηθεί ότι σε ορισµένες περιπτώσεις, οι ανήλικες µορφές του εντόµου δύνανται να παρουσιάσουν µικρές φαινοτυπικές διαφορές, οι οποίες ποικίλλουν και επηρεάζονται άµεσα από τα χαρακτηριστικά των φυτών στα οποία τρέφονται και αναπτύσσονται. Αυτές οι διαφορές αναφέρονται σε µεταβολές και αλλαγές στις ακίδες, τις τρίχες, τους πόρους και τις κηρώδεις προεξοχές, γεγονός που δεικνύει την υψηλή ικανότητα προσαρµογής του είδους στους φυτικούς ξενιστές του (Mohanty and Basu, 1986; Gill, 1990; Martin, 2003). Η µελέτη και η σύγκριση πληθυσµών του εντόµου από πολλές περιοχές του πλανήτη έδειξε ουσιαστική παραλλακτικότητα σε βιολογικούς και οικολογικούς χαρακτήρες, όπως η αναπαραγωγική συµπεριφορά, η ωοπαραγωγική δυνατότητα, η πτητική ικανότητα, η ανθεκτικότητα σε εντοµοκτόνα, η συµβίωση µε µικροοργανισµούς και η αποτελεσµατικότητα στη µετάδοση φυτικών ιών. Οι διαφορές αυτές, σε συνδυασµό µε τη χρήση µοριακών δεικτών αποτέλεσαν τη βάση για το χαρακτηρισµό των πληθυσµών αυτών και την ταξινόµηση τους σε βιοτύπους (Bird and Sanchez, 1971; Bird and Maramorosch, 1978; Brown et al., 2000). Ο όρος βιότυπος αναφέρεται σε µορφολογικά όµοιους πληθυσµούς του εντόµου, οι οποίοι παρουσιάζουν διαφορές στο γενετικό υλικό (DNA), καθώς και σε διάφορα άλλα οικολογικά και βιολογικά χαρακτηριστικά. Αυτές οι οµάδες (βιότυποι) των γενετικά παραπλήσιων, αλλά όχι όµοιων πληθυσµών του εντόµου, πιστεύεται ότι προήλθαν µέσα από µια εξελικτική διαδικασία και είναι αδύνατο να ταυτοποιηθούν µε οπτική παρατήρηση (Brown et al., 1995a; Perring, 2001). Κατά την τελευταία δεκαετία, η υιοθέτηση καινοτόµων µεθόδων για τη µελέτη και την ανάλυση των νουκλεϊνικών οξέων (DNA), έδωσε µια νέα ώθηση στην περαιτέρω διερεύνηση της γενετικής παραλλακτικότητας των διαφόρων τύπων του εντόµου. Σήµερα, προσδιορίζονται και αναφέρονται τουλάχιστον 20 διαφορετικοί βιότυποι, στους οποίους δόθηκαν ονοµασίες από το 23
λατινικό αλφάβητο (πχ. Α,Β,C,D,E,F,G,H,I,J,K,L,M,N,Τ,Q… κ.λπ.) (Brown et al., 2010). Στις χώρες της Μεσογειακής λεκάνης οι βιότυποι Β και Q αποτελούν τους συχνότερα απαντώµενους βιοτύπους του B. tabaci, οι οποίοι φαίνεται να ευθύνονται για τη διάδοση πολλών ιολογικών ασθενειών. Το γονίδιο της µιτοχονδριακής κυτοχρωµικής οξειδάσης (mitochondrial cytochrome oxidase I gene, mtCOI) αποτελεί τον πιο µελετηµένο µοριακό δείκτη για το φυλογενετικό χαρακτηρισµό και τη σχέση ανάµεσα στους βιοτύπους του είδους B. tabaci, και σήµερα χρησιµοποιείται ευρέως για το χαρακτηρισµό και το διαχωρισµό των βιοτύπων του είδους σε παγκόσµιο επίπεδο (Brown, 2007). Αυτό γιατί το µιτοχονδριακό γονιδίωµα κληροδοτείται από τα θηλυκά άτοµα στους απογόνους και οι µεταφραζόµενες περιοχές του παρουσιάζουν τον υψηλότερο βαθµό µεταλλάξεων, καθώς και την ταχύτερη εξέλιξη σε σχέση µε το πυρηνικό DNA (Brown, 1983). Η φυλογενετική ανάλυση πληθυσµών του B. tabaci από όλες τις περιοχές της υφηλίου κατέδειξε την ύπαρξη επτά κύριων φυλογενετικών συστάδων. Αυτές περιλαµβάνουν δύο κλάδους της Υποσαχάριας Αφρικανικής (I και II), ένα της βόρειο-αφρικανικής, µεσογειακής και µεσανατολικής (III), δύο της αυστραλασιακής (IV και V), και δύο των περιοχών της Τροπικής Αµερικής (VI και VII) (Εικόνα 11).
Εικόνα 11. Παγκόσµια γεωγραφική κατανοµή και φυλογενετικές συστάδες των πληθυσµών του B. tabaci µετά από ανάλυση του γονιδίου mtCOI.
24
Σχέσεις αλληλεπίδρασης των ιών του γένους Begomovirus µε τους αλευρώδεις φορείς τους Όλοι οι ιοί-µέλη του γένους Begomovirus εντοπίζονται στο φλοίωµα των προσβεβληµένων φυτών και µεταδίδονται αποκλειστικά µε το είδος B. tabaci (Gennadius), κατά έµµονο τρόπο. Συνεπώς για να επιτευχθεί, τόσο η πρόσληψη, όσο και η µετάδοση τους από τον αλευρώδη-φορέα, πρέπει το στιλέτο, που αποτελεί το διατροφικό όργανο του εντόµου, να διεισδύσει ανάµεσα από τα επιδερµικά και παρεγχυµατικά κύτταρα, ώστε να φτάσει µε τη σειρά του στους αγγειακούς ιστούς και το φλοίωµα για να προσλάβει τελικά τα απαραίτητα συστατικά (Pollard, 1955). Η µεταφορά των φυτικών συστατικών προς το σώµα του εντόµου γίνεται κυρίως παθητικά εξαιτίας της διαφοράς της πίεσης που επικρατεί µεταξύ των κοιλοτήτων των φυτικών ιστών και του πεπτικού του σωλήνα (Ghanim et al., 2001). Όταν διατρυπηθεί το φλοίωµα ενός προσβεβληµένου φυτού, το περιεχόµενο του χυµού µαζί µε τα ιοσωµάτια του ιού εισέρχονται στο τροφικό κανάλι του στιλέτου, οδηγούνται στον οισοφάγο και από εκεί στην κοιλία. Τα ιοσωµάτια του TYLCV εισέρχονται στο µέσο έντερο και µεταφέρονται στον αιµόλεµφο και από εκεί στους σιελογόνους αδένες για να εκκριθούν τελικά στο σάλιο. Κατά την τροφική του δραστηριότητα το έντοµο εκκρίνει σάλιο, ώστε να διευκολυνθεί η διείσδυση του στιλέτου στα φυτικά κύτταρα και µέσω αυτού µεταδίδονται οι ιοί στα φυτά. Ο χρόνος που απαιτείται από την πρόσληψη του ιού µέχρι και τη µετακίνηση του στο σάλιο, ώστε το έντοµο να καταστεί µολυσµατικό, καλείται λανθάνουσα περίοδος και υπολογίζεται ότι για τον TYLCV είναι περίπου 7 ώρες (Ghanim et al., 2001). Ο χρόνος αυτός ενδεχοµένως να µην αναφέρεται άµεσα στην ταχύτητα µετακίνησης του ιού µέσα από το σώµα του εντόµου, αλλά στο χρόνο που απαιτείται για να φτάσει σε ικανοποιητική συγκέντρωση και να προκαλέσει τη µόλυνση των φυτών. Τα αποτελέσµατα µελετών έδειξαν ότι απαιτούνται µόλις 10 λεπτά από την έναρξη της τροφικής δραστηριότητας σε προσβεβληµένο φυτό για να ανιχνευτεί ο ιός στο κεφάλι του εντόµου, και 40 λεπτά για να φτάσει στο µέσο έντερο. Τα ιοσωµάτια εισέρχονται στον αιµόλεµφο µετά από 90 λεπτά και καταλήγουν στους σιελογόνους αδένες σε 5.5 ώρες, δηλαδή µία περίπου ώρα προτού το έντοµο καταστεί µολυσµατικό (Εικόνα 12) (Ghanim et al., 2001). Γενικά πιστεύεται ότι η ταχύτητα και η 25
Εικόνα 12. Γραφική απεικόνιση της διάδοσης και του χρόνου που απαιτείται για τη µετακίνηση του TYLCV από το στιλέτο του B. tabaci στους σιελογόνους αδένες ώστε να καταστεί µολυσµατικός.
πορεία διακίνησης του ιού στους αλευρώδεις φορείς ισχύει για όλους τους ιούς µέλη του γένους Begomovirus ανεξάρτητα της γεωγραφικής προέλευσης του εντόµου φορέα. Από τη στιγµή που θα προσληφθεί, ο TYLCV εµµένει στο φορέα του για χρονικό διάστηµα πέραν των 4 εβδοµάδων, δηλαδή µέχρι και για ολόκληρη τη διάρκεια ζωής του (Rubinstein and Czosnek, 1997). Η µετάδοση του TYLCV επηρεάζεται άµεσα από το φύλο και την ηλικία του φορέα B. tabaci. Πιστεύεται ότι η ικανότητα µετάδοσης µειώνεται σηµαντικά όσο αυξάνεται η ηλικία των ατόµων. Σε σχετικά πειράµατα που έγιναν στο Ισραήλ, ενήλικα άτοµα ηλικίας 3 εβδοµάδων παρουσίασαν ποσοστό µετάδοσης του ιού 60% για τα θηλυκά άτοµα, και 20% για τα αρσενικά, ενώ για θηλυκά 6 εβδοµάδων η µετάδοση του ιού µειώθηκε στο 20% (Czosnek et al., 2001). Επιπλέον, η αύξηση της ηλικίας των εντόµων οδηγεί σε διαδοχική µείωση της ποσότητας των ιοσωµατίων που προσλαµβάνουν. Σύµφωνα µε µελέτες που έγιναν, οι αλευρώδεις 17 ηµερών προσέλαβαν τη µισή ποσότητα ιοσωµατίων του TYLCV σε σχέση µε έντοµα 10 ηµερών, ενώ άτοµα 24 ηµερών µόλις το 10% (Rubinstein and Czosnek, 1997). Ο ιός φαίνεται να επιδρά δυσµενώς και στη βιολογία του εντόµου φορέα. Ο χρόνος ζωής των ιοφόρων αλευρωδών ήταν περίπου 20% µικρότερος σε σχέση µε τους πληθυσµούς που δεν είχαν προσλάβει τον ιό (Rubinstein and Czosnek, 1997). Επιπλέον, στα ιοφόρα θηλυκά το ποσοστό ωοτοκίας µειώθηκε κατά 50% τουλάχιστο 20 ηµέρες µετά την πρόσληψη του ιού (Czosnek et al., 2001). Τα ιοσωµάτια των ιών Begomovirus πρέπει να διασχίσουν τα εντερικά τοιχώµατα, να εισέλθουν στον αιµόλεµφο και να καταλήξουν στους σιελογόνους αδένες. Το περιεχόµενο του εντερικού σωλήνα και του αιµόλεµφου συνίσταται από διάφορα ένζυµα και ουσίες και θεωρείται ιδιαίτερα εχθρικό για τα 26
ιοσωµάτια, που εκτίθενται σε άµεσο κίνδυνο καταστροφής. Οι ενδοσυµβιωτικοί µικροοργανισµοί των αλευρωδών παίζουν ένα σηµαντικό ρόλο στην ασφαλή και επιτυχή µετακίνηση των ιών στο σώµα των εντόµων. Ιδιαίτερα σηµαντικός είναι ο ρόλος του βακτηρίου Hamiltonella (και πιθανώς άλλων βακτηρίων) που αναπτύσσεται µέσα στον αιµόλεµφο των αλευρωδών B. tabaci. Ο µικροοργανισµός παράγει µεταξύ άλλων µια κατηγορία συνοδών πρωτεϊνών (Chaperons) της τάξης GroEL, οι οποίες αλληλεπιδρούν µε την καψιδιακή πρωτεΐνη του TYLCV, σχηµατίζοντας ένα σύµπλοκο που υποβοηθά και ασφαλίζει τη µεταφορά και τη διακίνηση των ιοσωµατίων µέσα στο σώµα του φορέα (Morin et al., 1999; Morin et al.,2000 Gottlieb et al., 2010). Η διακίνηση των φυτικών ιών στις ωοθήκες των θηλυκών φορέων και στα αυγά αποτελεί µια σπάνια περίπτωση. Μελέτες, που διεξήχθησαν στο αναπαραγωγικό σύστηµα των ιοφόρων θηλυκών του B. tabaci, έδειξαν ότι το DNA του TYLCV ανιχνεύτηκε στις ωοθήκες και τα αυγά TYLCV, που µε τη σειρά τους έδωσαν προνύµφες που έφεραν τον ιό, οι οποίες όταν εξελίχθηκαν σε ενήλικα είχαν τη δυνατότητα να µεταδόσουν τον ιό σε υγιή φυτά τοµάτας (Ghanim et al., 2001). Σε αντίστοιχες µελέτες για τον TYLCSV, ο ιός εντοπίστηκε σε αυγά και προνύµφες, αλλά τα ενήλικα άτοµα που προέκυψαν από τις προνύµφες αυτές δεν µπορούσαν να µεταδόσουν τον ιό (Bosco et al., 2004). Άλλες µελέτες έδειξαν αντίθετα αποτελέσµατα, σύµφωνα µε τα οποία ο TYLCV δεν ανιχνεύτηκε στα αυγά ούτε στους απογόνους των ιοφόρων θηλυκών. Πιστεύεται ότι οι διαφορές αυτές σχετίζονται µε την παρουσία διαφορετικών ενδοσυµβιωτικών βακτηρίων στους πληθυσµούς του B. tabaci που χρησιµοποιήθηκαν για τα πειράµατα. Στις περιπτώσεις απουσίας µολυσµένων φυτικών ξενιστών, ο TYLCV µεταδίδεται και µεταξύ των αλευρωδών φορέων. Η µετάδοση αναφέρθηκε τόσο από ιοφόρα αρσενικά σε θηλυκά, όσο και από ιοφόρα θηλυκά σε αρσενικά άτοµα, ενώ δεν παρατηρήθηκε µεταξύ ατόµων του ιδίου φύλου (Ghanim et al., 2001). Ο συγκεκριµένος τρόπος µετάδοσης αναφέρθηκε στις περιπτώσεις όπου τα ιοφόρα έντοµα τοποθετήθηκαν σε κλωβούς µε µη ιοφόρα. Τα ιοσωµάτια ανιχνεύτηκαν στον αιµόλεµφο των εντόµων που είχαν τραφεί αποκλειστικά σε υγιή φυτά, µόλις 1.5 ώρες µετά την επαφή τους µε τα ιοφόρα, χωρίς ωστόσο να ανιχνεύονται στο κεφάλι ή το έντερο. Πιστεύεται ότι ο ιός 27
µεταδίδεται από έντοµο σε έντοµο παρακάµπτοντας την συνηθισµένη τροφική οδό, µέσω της ανταλλαγής αιµολέµφου κατά την αναπαραγωγική διαδικασία. Από τον αιµόλεµφο, ο ιός µεταφέρεται στους σιελογόνους αδένες και τα έντοµα γίνονται ικανά να µολύνουν υγιή φυτά τοµάτας. Παρά τις πειραµατικές προσπάθειες, δεν κατέστη δυνατή η µετάδοση του ιού µεταξύ ατόµων του ιδίου φύλου (Ghanim et al., 2001). Bιότυποι του B. tabaci, η βακτηριακή τους µικροπανίδα και ο ρόλος τους στη µετάδοση του TYLCV στην Κύπρο Στην Κύπρο, ο αλευρώδης του καπνού θεωρείται ένας από τους πιο σηµαντικούς και οικονοµικά επιζήµιους εντοµολογικούς εχθρούς σχεδόν όλων των λαχανοκοµικών καλλιεργειών. Οι κλιµατικές συνθήκες της νήσου ευνοούν την ανάπτυξη υψηλών πληθυσµών του εντόµου, από την άνοιξη έως και το τέλος του φθινοπώρου, που φαίνεται να σχετίζονται, τόσο µε την πρόκληση άµεσων ζηµιών λόγω της τροφικής δραστηριότητας όσο και µε τη µετάδοση φυτικών ιών (Ioannou and Iordanou, 1985). Στα πλαίσια µιας διακρατικής συνεργασίας µε τη Γεωπονική Σχολή Θεσσαλονίκης κατά την περίοδο 2007/09 που χρηµατοδοτήθηκε από το Ίδρυµα Προώθησης Έρευνας, µελετήθηκε η παρουσία και η γενετική παραλλακτικότητα των πληθυσµών του B. tabaci από την Κύπρο και την Ελλάδα. Με στόχο την εξεύρεση αποτελεσµατικών µεθόδων για το µαζικό χειρισµό και την ανάλυση των εντόµων, συγκεντρώθηκαν και αναλύθηκαν πάνω από 200 νουκλεοτιδιακές αλληλουχίες του γονιδίου mtCOI από άτοµα που είχαν µελετηθεί σε διάφορες περιοχές του πλανήτη, αποσκοπώντας στον προσδιορισµό διαφορών και µεταλλάξεων µεταξύ των διαφόρων βιοτύπων. Ακολούθησε ο σχεδιασµός ειδικών µοριακών ανιχνευτών και µελετήθηκε η ικανότητα τους να ταυτοποιούν και να διαχωρίζουν τους βιοτύπους B και Q που είναι ιδιαίτερα διαδεδοµένοι στη µεσογειακή λεκάνη. Η νέα δοκιµή αξιολογήθηκε µε επιτυχία σε πληθυσµούς αλευρωδών από διάφορες χώρες της Ευρώπης, της µεσογειακής λεκάνης και της Αµερικής και συγκρίθηκε µε άλλες δηµοσιευµένες µεθόδους, (Bosco et al. 2006; Tsagkarakou et al. 2008), δίνοντας ταυτόσηµα αποτελέσµατα. Κατόπιν εφαρµόστηκε για το µαζικό µοριακό έλεγχο 1200 ενήλικων ατόµων που είχαν συλλεχθεί από όλες τις επαρχίες της ελεύθερης Κύπρου. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι στην Κύπρο εντοπίζονται, τόσο ο βιότυπος B όσο και ο βιότυπος Q, µε τον Β να κυριαρ28
Εικόνα 13. Φυλογενετική ανάλυση που δεικνύει τη συγγένεια των κυπριακών πληθυσµών (CY) του B. tabaci µε αντίστοιχους από άλλες χώρες.
χεί σε όλες τις κύριες λαχανοπαραγωγικές περιοχές µε ποσοστό 95%. Αντίθετα, ο βιότυπος Q εντοπίστηκε σε περιορισµένο αριθµό δειγµάτων (5%) στην περιοχή της Πόλεως Χρυσοχούς της Επαρχίας Πάφου. Η φυλογενετική ανάλυση του γονιδίου mtCOI επιλεγµένων ατόµων από διάφορες περιοχές συλλογής της Κύπρου και ποικίλους ξενιστές κατέδειξε ότι οι βιότυποι Β και Q κατατάσσονται στον βόρειο αφρικανικό-µεσογειακό-µεσανατολικό κλάδο του συµπλέγµατος του αλευρώδη του καπνού (Bemisia tabaci complex) (Εικόνα 13), παρουσιάζοντας υψηλά ποσοστά οµολογίας (98 ως 100%) µε αντίστοιχες αποµονώσεις από το Ισραήλ, τη Συρία και την Τουρκία, γεγονός που ενισχύει τις αρχικές υποθέσεις για µετανάστευση των εντόµων από αυτές τις περιοχές, που απέχουν µόλις µερικές δεκάδες χιλιόµετρα από τις βορειοανατολικές ακτές της νήσου (Papayiannis et al., 2009a; Papayiannis et al., 2009b). Με τη χρήση µεθόδων PCR προσδιορίστηκαν οι δευτερογενείς ενδοσυµ29
βιωτικοί µικροοργανισµοί που υπάρχουν στο σώµα των πληθυσµών του αλευρώδη του καπνού που συλλέχθηκαν από την Κύπρο. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι σε σύνολο 1000 ατόµων του B. tabaci που αναλύθηκαν, εντοπίστηκαν τα βακτήρια Hamiltonella sp. και Riketsia sp. σε ποσοστά 65 και 35%, αντίστοιχα, καθώς και τα Wolbachia sp., και Arsenophonus sp. σε ποσοστά 14 και 11%, αντίστοιχα. Τέλος, δεν ανιχνεύτηκαν οι µικροοργανισµοί Fritschea sp. και Cardinium sp. Σύµφωνα µε πρόσφατες µελέτες, η παρουσία των τύπων Hamiltonella sp. και Riketsia sp. σε υψηλά ποσοστά στους κυπριακούς πληθυσµούς είναι πιθανό να σχετίζεται µε τη µεγάλη ικανότητα µετάδοσης του ιού TYLCV (Papayiannis et al., 2009c). Παρόµοια αποτελέσµατα έχουν αναφερθεί και στο Ισραήλ και πιστεύεται ότι η παρουσία του είδους Hamiltonella sp. προστατεύει και διατηρεί σε υψηλή συγκέντρωση τα ιοσωµάτια στο σώµα των αλευρωδών-φορέων (Gottlieb et al., 2010). Η ευρεία διάδοση του βιοτύπου Β στην Κύπρο σχετίζεται άµεσα µε τις µεγάλες επιδηµίες και τη ραγδαία διάδοση αρκετών αλευρωδοµεταδιδόµενων ιών, που εκτός από τον TYLCV περιλαµβάνουν και τους ιούς του γένους Crinivirus που ευθύνονται για την πρόκληση των συµπτωµάτων ικτέρων σε καλλιέργειες κολοκυνθοειδών και σολανωδών, καθώς και του γένους Ipomovirus που σχετίζονται µε το κιτρίνισµα νεύρων σε αγγουριές και την παρακµή και αποπληξία που παρουσιάζεται σε καλλιέργειες καρπουζιάς. Συγκεκριµένα, από το γένος Crinivirus των φυτικών ιών έχουν αναφερθεί µέχρι στιγµής στην Κύπρο ο ιός του κίτρινου παραµορφωτικού νανισµού των κολοκυνθοειδών (Cucurbit yellow stunting disorder virus, CYSDV) (Papayiannis et al., 2005; Papayiannis et al., 2010b) και ο ιός της χλώρωσης της τοµάτας (Tomato chlorosis virus, ToCV) (Papayiannis et al., 2006), ενώ από το γένος Ipomovirus ο ιός των κίτρινων νεύρων της αγγουριάς (Cucumber vein yellowing virus, CVYV) (Papayiannis et al., 2005).
30
ΓΕΝΙΚΑ ΜΕΤΡΑ ΚΑΙ ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗΣ ΤΗΣ ΑΣΘΕΝΕΙΑΣ Η καταπολέµηση της ασθένειας είναι µια ιδιαίτερα δύσκολη και πολυσύνθετη υπόθεση, η οποία απαιτεί την προσέγγιση ποικίλων µεθόδων, πρακτικών και τρόπων ελέγχου τόσο των ιών που σχετίζονται µε την ασθένεια όσο και των αλευρωδών-φορέων. Είναι γενικά αποδεκτό ότι καµία µέθοδος από µόνη της δεν είναι αποτελεσµατική για καταστολή της ασθένειας. Αρκετοί συνδυασµοί φυτοϋγειονοµικών, καλλιεργητικών και χηµικών µέτρων επιστρατεύονται µε σκοπό αφενός την ελαχιστοποίηση των πηγών µολύσµατος της ασθένειας και αφετέρου τη µείωση του αριθµού και της διασποράς των αλευρωδών φορέων. Χρήση υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού Η φύτευση υγιών φυτών τοµάτας αποτελεί το κλειδί για την επιτυχή πρόληψη και αντιµετώπιση όλων των φυτοασθενειών. Η προµήθεια των σποροφύτων τοµάτας πρέπει να γίνεται από πιστοποιηµένες φυτωριακές µονάδες. Τα σπορόφυτα θα πρέπει να παράγονται µέσα σε εντοµοστεγή δίκτυα ώστε να αποτρέπεται η προσβολή από έντοµα και να ελαχιστοποιείται η πιθανότητα µόλυνσης τους. Μείωση των εστιών µόλυνσης Η έγκαιρη αποµάκρυνση των ασθενών ή καθ΄ υποψίαν προσβεβληµένων φυτών συµβάλλει σηµαντικά στην πρόληψη της διάδοσης της ασθένειας σε µια καλλιέργεια. Τα µολυσµένα φυτά θα πρέπει πρώτα να καλύπτονται µε πλαστικό σακούλι, να ξεριζώνονται, να αποµακρύνονται από την καλλιέργεια και να καταστρέφονται. Η πρακτική αυτή µειώνει τη δυνατότητα µετανάστευσης των ιοφόρων εντόµων από τα µολυσµένα φυτά στα γειτονικά. Το απλό κόψιµο ή το κλάδεµα των συµπτωµατικών τµηµάτων των φυτών δεν έχει οποιοδήποτε αποτέλεσµα, αφού ο ιός κυκλοφορεί στα φυτά και µπορεί να αποτελέσει πηγή για νέες µολύνσεις. Η µέθοδος αυτή δεν είναι επιτυχής στις περιπτώσεις που τα ποσοστά προσβολής στην καλλιέργεια είναι πάνω από 10%. Η καταστροφή των φυτών τοµάτας που φύονται σε ένα αγρό στις περιόδους που δεν υπάρχει καλλιέργεια (φυτά εθελοντές) είναι ιδιαίτερα σηµαντική για την καταστολή των πρωτογενών πηγών του µολύσµατος των ιολογικών ασθενειών. Οι τοµάτες που επιβιώνουν µετά το πέρας της καλλιεργητικής 31
περιόδου αποτελούν ένα άριστο ξενιστή για τη διατήρηση του ιού TYLCV και τη διαβίωση των αλευρωδών. Σε περιοχές όπου ενδηµεί η ασθένεια, το ρόλο των αρχικών πηγών του ιικού µολύσµατος αναλαµβάνουν αρκετά είδη ζιζανίων που φύονται εντός ή περιφερειακά των αγρών. Αυτά τα φυτά έχουν τη δυνατότητα να φιλοξενούν, τόσο τον ιό όσο και τους αλευρώδεις φορείς. Η καταστροφή των αυτοφυών φυτών θα πρέπει να εφαρµόζεται µε µέτρο και να επικεντρώνεται στα αγροτεµάχια που προορίζονται για φύτευση, αφού ως γνωστό τα ζιζάνια, εκτός από τους φορείς δυνατόν να φιλοξενούν και ωφέλιµα έντοµα τα οποία τρέφονται µε εχθρούς γεωργικής σηµασίας. Επίσης, η εφαρµογή αγρανάπαυσης για τουλάχιστον 2 µήνες ή αµειψισποράς µε καλλιέργειες που δεν προσβάλλονται από τους ιούς, που σχετίζονται µε το καρούλιασµα των φύλλων της τοµάτας, ελαττώνουν σηµαντικά τις πηγές µολύσµατος, τους φορείς και τη διάδοση της ασθένειας. Αντιµετώπιση των εντόµων φορέων Η χρήση εντοµοκτόνων ουσιών για τον έλεγχο του αλευρώδη του καπνού µπορεί σε γενικές γραµµές να µειώσει τους πληθυσµούς του εντόµου φορέα και κατ’ επέκταση να ελέγξει τη διάδοση της ασθένειας. Η χρησιµοποίηση της οµάδας των νεονικοτινοειδών εντοµοκτόνων έχει συµβάλει αρκετά στον έλεγχο των φορέων και των ιών. Παρ΄ όλα αυτά, η βιο-οικολογία, η συµπεριφορά και η διατροφική δραστηριότητα των αλευρωδών καθιστούν την αποτελεσµατική χηµική αντιµετώπιση µία εξαιρετικά δύσκολη υπόθεση. Συγκεκριµένα, οι αλευρώδεις τρέφονται στην κάτω επιφάνεια των φύλλων και το σώµα των προνυµφών τους φέρει κηρώδεις επιχρίσεις οι οποίες προσφέρουν προστασία από τις δυσµενείς συνέπειες των εντοµοκτόνων. Επιπλέον, η αλόγιστη χρήση των φυτοπροστατευτικών σκευασµάτων κατά τα τελευταία χρόνια έχει ενεργοποιήσει µηχανισµούς ανθεκτικότητας (Vassiliou et al.,και έχει συµβάλει στη µείωση των φυσικών εχθρών των εντόµων. Τα συµπεράσµατα των επιστηµόνων κατέδειξαν ότι η χρήση εντοµοκτόνων σκευασµάτων, ως το µοναδικό µέτρο αντιµετώπισης δεν είναι αρκετή και δεν µπορεί να προστατέψει τα φυτά από τους ιούς που προκαλούν την ασθένεια του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων της τοµάτας. Η κάλυψη των φυτών τοµάτας µε εντοµοστεγή δίκτυα (50-mesh), τα οποία εµποδίζουν την προσγείωση και την τροφική δραστηριότητα των εντόµων, αποτελεί ένα ιδιαίτερα αποτελεσµατικό µέτρο αντιµετώπισης της ασθένειας. 32
Η χρήση αντανακλαστικών επιφανειών από αλουµίνιο ή κίτρινο πλαστικό εφαρµόζεται µε επιτυχία σε πολλές χώρες για την προστασία των φυτών από έντοµα σε υπαίθριες καλλιέργειες τοµάτας. Η ακτινοβολία που αντανακλάται από αυτά τα υλικά αποπροσανατολίζει τα έντοµα και µειώνει αισθητά την ικανότητα τους να προσγειώνονται στα φυτά. Τα έντοµα, µη µπορώντας να βρουν το στόχο τους, αφυδατώνονται και πεθαίνουν. Η αποτελεσµατικότητα της τεχνικής αυτής εξαρτάται άµεσα και από τις κλιµατικές συνθήκες που επικρατούν σε µια περιοχή, αφού η ταχύτητα αφυδάτωσης των εντόµων επηρεάζεται από τη θερµοκρασία και την υγρασία που επικρατεί. Οι αλευρώδεις χρησιµοποιούν την υπεριώδη ακτινοβολία για να καθοδηγούνται προς τους ξενιστές τους. Η κάλυψη των θερµοκηπιακών εγκαταστάσεων µε ειδικά πλαστικά, τα οποία απορροφούν συγκεκριµένα µήκη κύµατος υπεριώδους ακτινοβολίας, εµποδίζει σε µεγάλο βαθµό την είσοδο και τη διασπορά των αλευρωδών στις καλλιέργειες. Η εξαπόλυση ωφέλιµων αρπακτικών εντόµων µέσα σε θερµοκήπια µπορεί να µειώσει αισθητά τους πληθυσµούς των αλευρωδών. Ανάµεσα στους σηµαντικότερους φυσικούς εχθρούς του B. tabaci συγκαταλέγονται διάφορα είδη των γενών Macrolophus sp., Orius sp., Neosidiocoris sp., Chrysoperla sp., κ.ά. Ανθεκτικές ποικιλίες τοµάτας Τα τελευταία 30 χρόνια έχει γίνει σηµαντική πρόοδος στην εξεύρεση ποικιλιών τοµάτας ανθεκτικών στην ασθένεια του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων, µε την ενσωµάτωση γονιδίων από διάφορα είδη άγριας τοµάτας. Πρόσφατα έχουν τεθεί στο εµπόριο αρκετές τέτοιες ποικιλίες µε καλά εµπορικά χαρακτηριστικά. Ένα πιθανό µειονέκτηµα των ποικιλιών αυτών είναι η έλλειψη ανθεκτικότητας σε εδαφογενή παθογόνα, όπως φουζάρια και βακτήρια, καθώς και η µειωµένη αποδοτικότητα. Υιοθέτηση ολοκληρωµένων προγραµµάτων παραγωγής Η υιοθέτηση ολοκληρωµένων στρατηγικών διαχείρισης και παραγωγής σε λαχανοκοµικά είδη έχει δώσει αποτελεσµατικά µέτρα για την αντιµετώπιση εχθρών και ασθενειών, τόσο σε υπαίθριες όσο και σε υπό κάλυψη καλλιέργειες. Τα προγράµµατα αυτά συνδυάζουν τη δυνατότητα εφαρµογής όλων των προαναφερόµενων µεθόδων ώστε να επιτευχθεί η καλύτερη δυνατή λύση για την προστασία της παραγωγής, των καταναλωτών και του περιβάλλοντος. 33
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
Abou-Jawdah, Y., Maalouf, R., Shebaro,W., and Soubra, K. 1999. Comparison of the reaction of tomato genotypes to infection by tomato yellow leaf curl begomovirus in Lebanon. Plant Pathology, 48, 727-734.
Accotto, G.P., Navas-Castillo, J., Noris, E., Moriones, E., and Louro, D. 2000. Typing of Tomato yellow leaf curl viruses in Europe. European Journal of Plant Pathology, 106, 179-186. Al-Bitar, L., and Luisoni, E. 1995. Tomato yellow leaf curl geminivirus: serological evaluation of an improved purification method. European Plant Protection Organization Bulletin, 25, 267-276.
Anfoka, G.H., Abhary, M., and Nakla, M.K. 2005. Molecular identification of species of the tomato yellow leaf curl complex in Jordan. Journal of Plant Pathology, 87, 61-66. Avidov, H.Z. 1944. Tobacco Whitefly in Israel. Tel Aviv: Hassadeh (in Hebrew), pp. 1–33.
Baumann P. 2005. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking incects. Annual Review of Microbiology, 59, 155-189.
Bedford, I.D., Kelly, A., Banks, G.K., Briddon, R.W., Cenis, J.L., and Markham, P. G. 1998. Solanum nigrum: An indigenous weed reservoir for tomato yellow leaf curl geminivirus in southern Spain. European Journal of Plant Pathology, 104, 221-222.
Bird, J., and Sanchez, J. 1971. Whitefly-transmitted viruses in Puerto Rico. Technical Paper, Agricultural Experiment Station, University of Puerto Rico, 55, 461–467. Bird, J., and Maramorosch, K. 1978. Viruses and virus diseases associated with whiteflies. Advances of Virus Research, 22, 55–110.
Blackman, R.L., and Cahill, M. 1998. The karyotype of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Bulletin of Entomological Research, 88, 213–215.
Bosco, D., Mason, G., and Accotto, G. P. 2004. TYLCSV DNA, but not infectivity, can be transovarially inherited by the progeny of the whitefly vector Bemisia tabaci (Gennadius). Virology, 323, 276–283.
Bosco, D., Loria, A., Sartor, C., and Cenis, J.L. 2006. PCR-RFLP Identification of Bemisia tabaci Biotypes in the Mediterranean Basin. Phytoparasitica, 34, 243-251.
Brown, J.K., Frohlich, D., and Rosell, R. 1995a. The sweet potato silver leaf whiteflies: biotypes of Bemisia tabaci (Genn.), or a species complex?. Annual Review of Entomology, 40, 511-534.
Brown, J.K., Coats, S.A., Bedford, I.D., Markham, P.G., Bird, J., and Frohlich, D.R. 1995b. Characterization and distribution of esterase electromorphs in the whitefly, Bemisia tabaci (Genn.) (Homoptera: Aleyrodidae). Biochemical Genetics, 33, 205-214.
Brown, J.K. 2000. Molecular markers for the identification and global tracking of whitefly vector-Begomovirus complexes. Virus Research, 71, 233-260.
Brown, J.K., Perring, T.M., Cooper, A.D., Bedford, I.D., and Markham, P.G. 2000. Genetic analysis of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) populations by isoelectric focusing electrophoresis. Biochemical Genetics, 38, 13-25.
34
Brown, J.K. 2007. The Bemisia tabaci species complex: Genetic and phenotypic variation and relevance to TYLCV-vector interactions. Tomato yellow leaf curl virus disease, management, molecular biology, breeding for resistance. H. Czosnek, Book, Springer, Netherlands, 25-56. Byrne, D.N., and Bellows, T.S. 1991. Whitefly Βiology. Annual Review of Entomology, 36, 431–457.
Campbell, B.C., and Dreyer, D.L. 1985. Host-plant resistance of sorghum; differential hydrolysis of pectic substances by polysaccharases of greenbug biotypes (Schizaphis graminum, Homoptera: Aphididae). Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 2, 203-215.
Campbell, B.C. 1993. Congruent evolution between whiteflies (Homoptera: Aleyrodidae) and their bacterial endosymbionts based on respective 18S and 16S rDNAs. Current Microbiology, 26, 129–132.
Campbell, B.C., Steffen-Campbell, J.D., and Gill, R. 1994. Evolutionary origin of whiteflies (Hemiptera: Sternorrhyncha: Aleyrodidae) inferred from 18S rDNA sequences. Insect Molecular Biology, 3, 73-89.
Chiel, E., Gottlieb, Y., Zchori- Fein, E., Mozes- Daube, N., Katzir, N., Inbar, M., and Ghanim, M. 2007a. Biotype-dependent secondary symbiont communities in sympatric populations of Bemisia tabaci. Bulletin of Entomological Research, 97, 1-7. Chiel, E., Gottlieb, Y., Inbar, M., Zchori-Fein, E., and Ghanim, M. 2007b. Distribution of secondary symbionts in Israeli populations of Bemisia tabaci. Bulletin of Entomological Research, 97:407–413.
Cohen, S., and Nitzany, F.E. 1960. Curly top virus of tomatoes: its identification and mode of transmission. Report No. 311 of the Israeli Plant Protection and Inspection Services (in Hebrew). Cohen, S., Nitzany, F.E., and Harpaz, I. 1963. Tests for the control of tomato top yellowing virus. Hassadeh (in Hebrew) 43, 576–578.
Cohen, S., and Nitzany, F.E. 1966. Transmission and host range of tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology, 56, 1127–1131.
Costa, H.S., Westcot, D.M., Ullman, D.E., and Johnson, M.W. 1993a. Ultrastructure of the endosymbionts of the whitefly, Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum. Protoplasma, 176, 106–115.
Costa, H.S., Brown, J.K., Sivasupramaniam, S., and Bird, J. 1993b. Regional distribution, insecticide resistance, and reciprocal crosses between the “A” and “B” biotypes of Bemisia tabaci. Insect Scientific Application, 14, 127–138.
Crescenzi, A.S., Comes, C., Napoli, A., Fanigliulo, R., Pacella A., and Accotto, G.P. 2004. Severe outbreaks of tomato yellow leaf curl sardinia virus in Calabria, southern italy. Communication in Agricultural and Applied Biological Sciences, 69, 575-580. Czosnek, H., Ber, R., Antignus, Y., Cohen, S., Navot, N., and Zamir, D. 1988. Isolation of tomato yellow leaf curl virus, a geminivirus. Phytopathology, 78, 508–512.
35
Czosnek, H., and Latterot, H., 1997. A worldwide survey of tomato yellow leaf curl viruses. Archives of Virology, 142, 1391-1406.
Czosnek, H., Ghanim, M., Morin, S., Rubinstein, G., Fridman, V., and Zeidan, M. 2001.Whiteflies: vectors, and victims (?) of geminiviruses. In Advances of Virus Research, (ed. Maramorosch, K.). Academic Press pp. 291–322. Dalmon, A., Cailly, M., and David, C. 2000. Comparison of serological and molecular techniques for detection of Tomato yellow leaf curl begomovirus. European Plant Protection Organization Bulletin, 30, 457-462.
Davino, S., Davino, M., and Accotto, G.P. 2008. A single-tube PCR assay for detecting viruses and their recombinants that cause tomato yellow leaf curl disease in the Mediterranean basin. Journal of Virological Methods, 147, 93-98. Gal-On, Α., Naglis, Α., Leibman, D., Ziadna, H., Kathiravan, K., Papayiannis, L., Holdengreber, V., Guenoune-Gelbert, D., Lapidot, M., and Aly R. 2009. Broomrape can acquire viruses from its hosts. Phytopathology, 99, 1321-1329.
García-Andrés, S., Monci, F., Navas-Castillo, J., and Moriones, E. 2006. Begomovirus genetic diversity in the native plant reservoir Solanum nigrum: evidence for the presence of a new virus species of recombinant nature. Virology, 350, 433-442. Gerling, D. 1986. Natural enemies of Bemisia tabaci, biological characteristics and potential as biological control agents: a review. Agriculture, Ecosystems and Environment, 17, 99-110.
Gennadius, P. 1890. Disease of tobacco plantations in the Trikonia. The aleyrodid of tobacco. Ellinike Georgia 5, 1-3. (In Greek).
Ghanim, M., Morin, S., and Czosnek, H. 2001. Rate of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). Translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology, 91:188-196. Gill, R.J. 1990. The morphology of whiteflies. In Whiteflies: Their Bionomics, Pest Status, and Management (ed. Gerling, D.). Andover, Hants, Intercept Ltd, England. pp. 13–45.
Gorsane, F., Gharsallah-Chouchene, S., Nakhla, M.K., Fekih-Hassan, I., Maxwell, D.P., Marrakchi M., and Fakhfakh H., 2005. Simultaneous and rapid differentiation of members of the tomato yellow leaf curl virus complex by multiplex PCR. Journal of Plant Pathology, 87, 39-44. Gottlieb, Y., Ghanim, M., Chiel, E., Gerling, D., Portnoy, V., Steinberg, S., Tzuri, G., Horowitz, A.R., Belausov, E., Mozes-Daube, N., Kontsedalov, S., Gershon, M., Gal, S., Katzir, N., and Zchori-Fein, E. 2006. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Applied and Environmental Microbiology, 72, 3646–3652.
Gottlieb, Y., Zchori-Fein, E., Mozes-Daube, N., Kontsedalov, S., Skaljac, M., Brumin, M., Sobol, I., Czosnek, H., Vavre, F., Fleury, F., and Ghanim, M. 2010. The transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus by the whitefly Bemisia tabaci is correlated with the presence of a specific symbiotic bacterium species. Journal of Virology, 84:9310-9317.
36
Everett, K.D.E., Thao, M., Horn, M., Dyszynski, G.E., and Baumann, P. 2005. Novel chlamydiae in whiteflies and scale incects: endosymbionts ‘Candidatus Fritschea bemisiae’ strain Falk and ‘Candidatus Fritschea eriococci strain Elm. International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology, 55, 1581-1587. Fauquet, C.M., Briddon, R.W., Brown, J.K., Moriones, E., Stanley, J., Zerbini, M., and Zhou, X. 2008. Geminivirus strain demarcation and nomenclature. Archives of Virology, 153, 783–821. Hanley-Bowdoin, L., Settlage, S.B., Orozco, B.M., Nagar, S., and Robertson, D. 2000. Geminiviruses: models for plant DNA replication, transcription, and cell cycle regulation. Critical Reviews of Biochemistry and Molecular Biology, 35, 105–140. Ioannou, N. 1985. Yellow leaf curl and other virus diseases of tomato in Cyprus. Plant Pathology, 34, 428-434.
Ioannou, N., and Iordanou, N. 1985. Epidemiology of tomto yellow leaf curl virus in relation to the population density of its whitefly vector, Bemisia tabaci (Gennadius). Agricultural Research Institute, Technical Bulletin, 71.
Ioannou, N. 1987. Cultural management of tomato yellow leaf curl disease in Cyprus. Plant Pathology, 36, 367-373.
Ioannou, N., Kyriakou, A., and Hadjinicolis, A. 1987. Host range and natural reservoirs of tomato yellow leaf curl virus. Agricultural Research Institute, Technical Bulletin, 85.
Inoue-Nagata, A.K., Albuquerque, L.C., Rocha, W.B., and Nagata, T. 2004. A simple method for cloning the complete begomovirus genome using the bacteriophage phi29 DNA polymerase. Journal of Virological Methods, 116, 209–211. Jorda, C., Font, I., Martinez, P., Juarez, M., and Ortega, A. 2001. Current status and new natural hosts of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) in Spain. Plant Disease, 85, 445.
Jones, D.R. 2003. Plant viruses transmitted by whiteflies. European Journal of Plant Pathology, 109, 195-219.
Kashina, B.D., Mabagala, R.B., and Anatolia, A. 2002. Molecular characterization of isolates of Tomato yellow leaf curl from Tanzania. Archives of Phytopathology and Plant Protection, 35, 255-267. Lapidot, M. 2002. Screening common bean (Phaseolus vulgaris) for resistance to tomato yellow leaf curl virus. Plant Disease, 86, 429–432.
Lazarowitz, S.G. 1992. Geminivirus: Genome structure and gene function. Critical Review of Plant Sciences, 11, 327-349.
Leonardo, T.E., and Mondor, E.B. 2006. Symbiont modifies host life history traits that affect gene flow. Proceedinigs of the Royal Society B, 273, 1079-1084. Martin, J.H. 2003. Whiteflies (Hemiptera: Aleyrodidae) – their systematic history and the resulting problems of conventional taxonomy, with special reference to descriptions of Aleyrodes proletella (Linnaeus, 1758) and Bemisia tabaci (Gennadius, 1889). Entomological Gazette 54, 125–136.
37
Martinez-Culebras, P.V., Font, I., and Jorda, C. 2001. A rapid PCR method to discriminate between tomato yellow leaf curl virus isolates. Annals of Applied Biology, 139, 251257.
Martinez-Zubiaur, Y., Fonseca, D., Quiñones, M., and Palenzuela, I. 2004. Presence of tomato yellow leaf curl virus infecting squash (Curcubita pepo) in Cuba. Plant Disease, 88, 572. Mason, G., Caciagli, P., Accotto, G.P., and Noris. E. 2008. Real-time PCR for the quantitation of Tomato yellow leaf curl sardinia virus in tomato plants and in Bemisia tabaci. JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, 147, 282-289.
Mohanty, A.K., and Basu, A.N. 1986. Effect of host plants and seasonal factors on intraspecific variations in pupal morphology of the whitefly vector, Bemisia tabaci (Genn.) (Homoptera: Aleyrodidae). Journal of Entomological Research, 10, 19–26.
Montllor, C.B., Maxmen, A., and Purcell, A.H. 2002. Facultative bacterial endosymbionts benefit pea aphids Acyrthosiphon pisum under heat stress. Ecological Entomology, 27, 189–195. Morilla, G., Janssen, D., García-Andrés, S., Moriones, E., Cuadrado, I.M., and Bejarano, E.R. 2005. Pepper (Capsicum annuum) is a dead-end host for tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology, 95, 1089–1097.
Morin, S., Ghanim, M., Sobol, I., and Czosnek, H. 2000. The GroEL protein of the whitefly Bemisia tabaci interacts with the coat protein of transmissible and non-transmissible begomoviruses in the yeast two-hybrid system. Virology, 276, 404–416.
Morin, S., Ghanim, M., Zeidan, M., Czosnek, H., Verbeek, M., and Van den Heuvel J.F.J.M. 1999. A GroEL homologue from endosymbiotic bacteria of the whitefly Bemisia tabaci is implicated in the circulative transmission of tomato yellow leaf curl virus. Virology, 30,75-84. Mound, L.A., and Halsey, S.H. 1978. Whiteflies of the world: a systematic catalogue of the aleyrodidae (Homoptera) with host plant and natural enemy data. British Museum (Natural History), London ,UK, John Wiley & Sons, Chichester, 329pp. Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., and Czosnek, H. 1991. Tomato yellow leaf curl virus: a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology, 185, 131–161.
Papayiannis, L.C., Ioannou, N., Boubourakas, I.N., Dovas, C., Katis, N.I., and Falk, B.W. 2005. Incidence of viruses infecting cucurbits in Cyprus. Journal of Phytopathology 153,530-535.
Papayiannis, L.C., Ioannou, N., Dovas, C.I., Maliogka, V.I., and Katis, N.I. 2006. First report of tomato chlorosis virus in Cyprus. Plant Pathology, 55, 567.
Papayiannis, L.C., Avgelis, A.D., Ioannou, N., and Katis, N.I. 2007a. First report of tomato yellow leaf curl sardinia virus (TYLCSV) on tomato crops in Greece. Plant Pathology 56, 341. Papayiannis, L.C., Paraskevopoulos, A., and Katis, N.I. 2007b. First report of tomato yellow leaf curl virus infecting common Bean in Greece. Plant Disease 91, 465.
38
Papayiannis, L.C., Brown, J.K., Hadjistylli, M., and Katis, N.I. 2008a. Bemisia tabaci biotype B associated with tomato yellow leaf curl disease epidemics in Rhodes Island, Greece. Phytoparasitica 36, 20-22.
Papayiannis, L.C., Savvides, A., Chatziafksentis, Kapari-Isaia, T., Dovas, C., and Katis, N.I. 2008b. Incidence of viruses infecting tomato crops in Cyprus. In: Phytopathologia Mediterranea 47, 159. Papayiannis, L.C., Brown, J. K., Seraphides, N.A., Hadjistylli, M., Ioannou, N., and Katis, N.I. 2009a. A real-time PCR assay to differentiate the B and Q biotypes of the Bemisia tabaci complex in Cyprus. Bulletin of Entomological Research, 99, 573-582.
Papayiannis, L.C., Brown, J.K., Idris, A.M., Paraskevopoulos, A., and Katis, N.I. 2009b. Epidemiology and characterization of begomovirus and Bemisia tabaci biotypes in Greece and Cyprus. Phytopathologia Mediterranea 48, 320.
Papayiannis, L.C., and Katis, N.I. 2009c . Differentiation of begomoviruses infecting tomato crops and Bemisia tabaci biotypes using Real-Time PCR. Proceedings EPPO Diagnostics Conference, 10-13 May, 2009, York, UK, p.32.
Papayiannis, L.C., Iacovides, T.A., Katis, N.I., and Brown, J.K. 2010a. Differentiation of tomato yellow leaf curl virus and tomato yellow leaf curl Sardinia virus using realtime TaqMan PCR. Journal of Virological Methods, 165, 238-245. Papayiannis, L.C., Hunter, S.C., Iacovides, T.A., and Brown, J.K. 2010b. Detection of cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV) in cucurbit leaves using sap extracts and real time TaqMan reverse transcription (RT) polymerase chain reaction (PCR). Journal of Phytopathology 158, 487-495. Παπαγιάννης, Λ.Χ., Brown, J.K., Παρασκευόπουλος, Α., και Κατής, Ν.Ι. 2010. Ταυτοποίηση και επιδηµιολογικά χαρακτηριστικά των ιών που σχετίζονται µε την ασθένεια του κίτρινου καρουλιάσµατος των φύλλων σε Ελλάδα και Κύπρο. Πρακτικά Περιλήψεων15º Πανελλήνιο Φυτοπαθολογικó Συνέδριο, Κέρκυρα 5-8 Οκτωβριου 2010, σελ. 113.
Papayiannis, L.C., Katis, N.I., Idris, A.M., and Brown J.K. 2011. Identification of weed hosts of tomato yellow leaf curl virus in Cyprus. Plant Disease, 95, 120-125. Perring, T.M. 2001.The Bemisia tabaci species complex. Crop Protection , 20, 725-737.
Pollard, D.G. 1955. Feeding habits of the cotton whitefly, Bemisia tabaci Genn. Annals of Applied Biology, 43: 664-671.
Polston, J. E., Cohen, L., Sherwood, T. A., Ben-Joseph, R., and Lapidot, M. 2006. Capsicum species: symptomless hosts and reservoirs of tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology 96, 447–452.
Reina, J., Morilla, G., Bejarano, E. R., Rodriguez, M. D., and Janssen, D. 1999. First report of Capsicum annuum plants infected by tomato yellow leaf curl virus. Plant Disease, 83,1176.
Rojas, M. R., Kon, T., Natwick, E. T., Polston, J. E., Akad, F., and Gilbertson, R. L. 2007. First report of tomato yellow leaf curl virus associated with tomato yellow leaf curl disease in California. Plant Disease, 91,1056.
39
Rubinstein, G., and Czosnek, H. 1997. Long-term association of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) with its whitefly vector Bemisia tabaci: effect on the insect transmission capacity, longevity and fecundity. Journal of General Virology, 78, 2683-2689. Russo, I., Cohen, S., and Martelli, G.P. 1980. Virus-like particles in tomato plants affected by the yellow leaf curl disease. Journal of General Virology, 49, 209–213.
Salati, R., Nahkla, M.K., Rojas, M.R., Guzman, P., Jaquez, J., Maxwell, D.P., and Gilbertson, R.L. 2002. Tomato yellow leaf curl virus in the Dominican Republic: characterization of an infectious clone, virus monitoring in whiteflies, and identification of reservoir hosts. Phytopathology , 92, 487-496.
Sanchez-Campos, S., Navas-Castillo, J., Camero, R., Soria, C., Diaz, J.A., and Moriones, E. 1999. Displacement of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)-Sr by TYLCV-Is in tomato epidemics in Spain. Phytopathology, 89,1038-1043.
Thao, M.L., and Baumman, L. 2004. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Applied and Environmental Microbiology, 70, 3401–3406. Thomas, J.E., Massalski, P.R., and Harrison, B.D. 1986. Production of monoclonal antibodies to African cassava mosaic virus and differences in their reactivities with other whitefly-transmitted geminiviruses. Journal of General Virology 67, 2739 - 2748.
Tiberini Α., Tommasoli L., Barba, M., and Hadidi, A. 2010. Oligonucleotide microarray-based detection and identification of 10 major tomato viruses. Journal of Virological Methods, 168: 133-140.
Tsagkarakou, A., Tsigenopoulos, C.S., Gorman, K., Lagnel, J., and Bedford, I.D. 2008. Biotype status and genetic polymorphism of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) in Greece: mitochondrial DNA and microsatellites. Bulletin of Entomological Research, 97, 29-40.
Varma, A., and Malathi, V.G., 2003. Emerging geminivirus problems, a serious threat to crop production. Annals of Applied Biology, 142, 145–164.
Vassiliou, V., Emmanoulidou, M., Perrakis, A., Morou, E., Vontas, J., Tsagkarakou, A., and Roditakis, E. 2011. Insecticide resistance in Bemisia tabaci from Cyprus. Insect Science, 18, 30-39. Yokomi, R.K., Hoelmer, K.A., and Osborne, L.S. 1990. Relationship between the sweetpotato whitefly and the squash silverleaf disorder. Phytopathology, 80, 895-900.
Zchori-Fein, E., and Brown, J. K. 2002. Diversity of prokaryotes associated with Bemisia tabaci (Genn.) (Hemiptera: Aleyrodidae). Annals of Entomological Society of America, 95, 711–718.
40